LINC00839靶向调控miR-124-3p对膀胱癌细胞生物学行为的影响

吴潇芸，吴林秀，张丽娣，蓝一笔，张明津，易楚繁，付伟金△

膀胱癌（BC）是泌尿系统常见的恶性肿瘤［1］，分为非肌层浸润性BC（NMIBC）和肌层浸润性BC（MIBC）两种［2］。MIBC 主要治疗方法为根治性膀胱切除术（RC），但部分MIBC患者行RC术后仍然发生转移［3］，转移性或晚期MIBC 患者临床疗效不佳［4］。若能明确BC 患者侵袭及转移相关信号通路及调控机制，对发现BC 治疗新靶点和药物，提高诊断及预后具有重要意义。本课题组前期发现miR-124-3p在BC 细胞和组织中低表达，转染miR-124-3p mimics可抑制BC细胞增殖，降低细胞侵袭力和内皮素受体B（EDNRB）表达，从而影响BC细胞增殖和侵袭［5］。长链非编码RNA（LncRNA）可通过内源性竞争性RNA机制（ceRNA）与miRNA发生竞争性结合，调控miRNA下游靶基因，从而影响恶性肿瘤相关生物学行为［6-7］。LINC00839 已被证实在肝癌、食管癌等多种恶性肿瘤中过表达［8-9］，而目前LINC00839是否参与调控BC细胞的增殖和侵袭还有待研究。本研究拟检测LINC00839 在BC 组织和细胞中的表达情况，验证其与miR-124-3p的相关性，探究LINC0083对BC细胞增殖及侵袭等生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床标本收集 选取2021年4月1月—2022年5月31日于广西医科大学第一附属医院泌尿外科行RC的BC患者。纳入标准：（1）术前未接受放疗或化疗。（2）术后病理诊断为膀胱尿路上皮癌。最终纳入15例，分别取同一患者的BC组织和癌旁正常组织（距离肿瘤≥2 cm 的膀胱正常黏膜组织），术后均经HE染色病理证实。标本在手术切除后10 min之内获得，取材后置于无菌冻存管中，储存至-80 ℃低温冰箱。本研究经广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准（2021-ky-国基-193），患者知情同意并签署知情同意书。

1.1.2 试剂和仪器 人膀胱癌细胞系T24、5637、EJ 购自中科院上海细胞研究所；Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Introgen公司；RP1640培养液及10%胎牛血清购自美国Gibco公司；一抗兔源EDNRB 蛋白、二抗羊抗兔IgG、内参GAPDH购自美国Abcam 公司；干扰序列：si-LINC00839-1（GCU⁃AGAAGUUGUUAGUUUACU）、si-LINC00839-2（GCUACA⁃AUGAGUAAUCUAAUG）、s-LINC00839-3（GGUUGUGGAU⁃UUACAGGAAUG）购自赛索飞生物公司；miR-124-3p mimics（UAAGGCACGCGGUGAAUGCCAA）、LINC00839 野 生 型（WT-LINC00839）和突变型（MUT-LINC00839）荧光素酶报告基因载体购自广州锐博生物公司；细胞计数试剂盒（CCK-8）购自美国Sigma 公司；Transwell 小室购自美国Corning 公司；实时荧光定量PCR（qPCR）仪购自美国ABI公司；倒置显微镜和荧光显微镜购自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染和实验分组 T24、5637、EJ 细胞在RPMI1640 培养基（含10%胎牛血清，5%CO2、37 ℃）培养，取对数生长期细胞进行实验，检测LINC00839相对表达量高者为研究细胞。将3 条si-LINC00839 序列转染BC 细胞，分为si-LINC00839-1组、si-LINC00839-2组、si-LINC00839-3组，RNA 干扰阴性对照组（si-NC 组）仅添加等量转染试剂。qPCR筛选出抑制效率最高的siRNA序列，进入下一步实验。

1.2.2 qPCR检测mRNA表达水平 按照Trizol使用说明书提取BC组织及细胞总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板，利用荧光定量试剂盒于Life 7500序列检测系统行定量PCR 分析。引物序列由上海生工生物有限公司合成。LINC00839 引物序列：上 游5'-TAAATAGTTGCTCCGT⁃GGGCT-3'，下游5'-GCCTGGCCCTCTTCTTTCTC-3'，产物大小100 bp；miR-124-3p 引物序列：上游5'-GTCGTATCCAGTG⁃CAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGCATT-3'，下游5'-TAAGGCACGCGGTGAATGCC-3'，产物大小48 bp；内参GAPDH 引物序列：上游5'-GAGTCAACGGATTTGGTC⁃GT-3'，下游5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'，产物大小185 bp。反应条件：95 ℃预变性120 s；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共40 个循环。各组实验重复3 次，以GAPDH 为内参，利用2-ΔΔCt法计算LINC00839和miR-124-3p相对表达量。

1.2.3 CCK-8检测LINC00839对BC细胞增殖的影响 取对数生长期BC 细胞，调整密度为5×103个/mL，将其置于96 孔板培养，分别将si-LINC00839-2转染24、48、72、96 h后，添加10µL CCK-8试剂，37 ℃细胞培养箱共培养1 h，酶标仪（450 nm）检测光密度（OD）值，以OD 值代表细胞增殖率，各组实验重复3次。

1.2.4 Transwell 检测BC 细胞侵袭 Transwell 小室内铺满无血清培养液稀释的基质胶，si-LINC00839-2 转染BC 细胞48 h 后，密度为5×104个/mL 细胞悬液加入上室，下室加入含10%胎牛血清的培养液；培养48 h 后，取出小室，PBS 洗涤，95%乙醇固定，用0.1%结晶紫染色。高倍显微镜下，选择不少于5个随机视野计数穿膜细胞数，各组实验重复3次。

1.2.5 流式细胞术检测BC细胞凋亡 si-LINC00839-2转染各组BC细胞48 h后，收集5×105个细胞，1 000 r/min离心5 min，弃去培养液。PBS 洗涤1 次，加入预冷的70%乙醇于4 ℃固定2 h。PI 染液染色后4 ℃避光30 min。流式细胞仪检测早期和晚期BC细胞凋亡率，各组实验重复3次。

1.2.6 双荧光素酶实验检测miR-124-3p荧光素酶活性 采用在线软件Snap Gene 4.1.9 进行靶基因预测比对，显示LINC00839 和miR-124-3p 之间可能存在特异性结合位点。将LINC00839-WT 和LINC00839-MUT 分 别 与miR-124-3p mimics 和miR-124-3p-NC 共转染至BC 细胞，转染48 h 后检测各组细胞的荧光素酶活性，各组实验重复3次。

1.2.7 Western blot 法检测EDNRB 蛋白的表达 si-LINC00839-2转染各组细胞48 h后，用细胞裂解液提取各组细胞总蛋白，配置10%分离胶和5%浓缩胶，每孔上40µg蛋白进行SDS-PAGE 后转至PVDF 膜，封闭后，加入兔抗小鼠EDNRB单克隆抗体（1∶1 000），4 ℃过夜。洗涤后加二抗室温孵育2 h，洗涤，DAB显色，成像，GAPDH作为内参，各组实验重复3次。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0 软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，2组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对t检验；多组间均数比较采用单因素方差分析，组间多重比较行LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC00839 在BC 组织和细胞的表达情况 LINC00839 在BC 的表达水平高于癌旁正常组织（1.75±1.07vs.1.01±0.41，n=15，t=2.656，P＜0.05）。普通倒置显微镜观察T24、5637、EJ细胞处于对数生长期，细胞生长良好，见图1。LINC00839 在T24、5637、EJ 表达水平分别为0.88±0.09、0.91±0.08、0.16±0.04（n=3，F=102.862，P＜0.05），在BC5637 细胞中表达最高。

Fig.1 Bladder cancer cells in logarithmic growth stage(×100)图1 对数生长期的BC细胞（×100）

2.2 si-LINC00839 干扰效率 qPCR 检测结果显示si-NC 组、si-LINC00839-1 组、si-LINC00839-2 组、si-LINC00839-3 组中LINC00839 表达水平分别为1.19±0.17、0.78±0.06、0.38±0.03 和0.58±0.02（n=3，F=42.860，P＜0.05），si-LINC00839-2 抑制效率最高，选择其进行后续研究。

2.3 沉默LINC00839 对BC5637 细胞miR-124-3p表达的影响 qPCR检测结果显示，si-LINC00839-2组miR-124-3p 表达较si-NC 组增加（1.68±0.13vs.1.02±0.25，n=3，t=4.019，P＜0.05）。

2.4 沉默LINC00839 表达对BC5637 细胞增殖的影响 CCK-8 实验结果表明，与si-NC 组相比，si-LINC00839-2 组48、72 和96 h 细胞增殖率下降（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Comparison of BC cell proliferation at different time points between the two groups表1 2组BC细胞不同时间点增殖情况比较（n=3，OD450，±s）

Tab.1 Comparison of BC cell proliferation at different time points between the two groups表1 2组BC细胞不同时间点增殖情况比较（n=3，OD450，±s）

＊P＜0.05。

组别si-NC组si-LINC00839-2组t 24 h 0.33±0.00 0.34±0.00 1.957 48 h 0.62±0.02 0.41±0.01 17.122＊72 h 1.16±0.03 0.67±0.02 23.534＊96 h 2.49±0.07 1.03±0.04 31.981＊

2.5 沉默LINC00839 表达对BC5637 细胞侵袭的影响 Transwell 侵袭实验结果显示，si-LINC00839-2组较si-NC 组穿膜细胞数（个/视野）减少（159.66±51.07vs.330.33±89.91，n=3，t=2.859，P＜0.05），见图2。

2.6 沉默LINC00839 表达对BC5637 细胞凋亡的影响 流式细胞实验结果显示，si-LINC00839-2 组较si-NC组早期［（2.90±0.36）%vs.（0.27±0.05）%，n=3，t=12.531，P＜0.05）］和晚期BC 细胞凋亡率［（7.96±0.34）%vs.（6.52±0.51）%，n=3，t=4.093，P＜0.05）］增加，见图3。

Fig.2 Effects of silencing LINC00839 on the invasion of bladder cancer 5637 cells(crystal violet staining,×100)图2 沉默LINC00839表达对BC5637细胞侵袭的影响（结晶紫染色，×100）

Fig.3 Effects of silencing LINC00839 on the apoptosis of bladder cancer 5637 cells图3 沉默LINC00839表达对BC5637细胞凋亡的影响

2.7 双荧光素酶实验检测LINC00839 与miR-124-3p 的 关 系 LINC00839 与miR-124-3p 之 间 存 在 互补结合位点，见图4。miR-124-3p-NC+LINC00839-WT 组、miR-124-3p mimics+LINC00839-WT 组、miR-124-3p-NC+LINC00839-MUT 组、miR-124-3p mimics+LINC00839-MUT 组的荧光素酶相对活性分别为0.86±0.06、0.52±0.05、0.92±0.02、0.86±0.03。与miR-124-3p-NC+LINC00839-WT 组 相 比，miR-124-3p mimics+LINC00839-WT 组荧光素酶相对活性下降（n=3，t=7.667，P＜0.05）；miR-124-3p-NC+LINC00839-MUT 组 与 miR-124-3p mimics+LINC00839-MUT组相比，荧光素酶相对活性差异无统计学意义（n=3，t=0.271，P＞0.05）。

Fig.4 The binding sites of LINC00839 with miR-124-3p图4 LINC00839与miR-124-3p结合位点

2.8 沉默LINC00839 对EDNRB 蛋白表达的影响 Western blot 检测结果显示，si-LINC00839-2 组较si-NC 组EDNRB 蛋白表达下降（0.27±0.04vs.0.49±0.16，n=3，t=2.291，P＜0.05），见图5。

Fig.5 Effects of silencing LINC00839 on the expression of EDNRB protein in bladder cancer 5637 cells图5 沉默LINC00839对BC5637细胞EDNRB表达的影响

3 讨论

LncRNA 是一类长度大于200 bp 的非编码RNA，缺少特异完整开放阅读框架，无蛋白质编码功能的RNA［10］。研究证实LncRNA参与调控多种恶性肿 瘤 的 恶 性 生 物 学 行 为［11-12］。Cao 等［13］发 现，LncRNA-RMRP 通过miR-125a-5p 调控BC 细胞的增殖和侵袭。Luo等［14］发现，LncRNA RP11-89通过miR-129-5p/PROM2 分子轴促进BC 细胞的增殖和侵袭能力。

LINC00839 已被证实与多种肿瘤细胞的发生、发展密切相关。沉默LINC00839表达可促进神经母细 胞 瘤IMR-32 和SK-N-SH 细 胞 凋 亡［15］。LINC00839 在乳腺癌组织和细胞过表达，沉默LINC00839后可抑制乳腺癌细胞增殖［16］。相关研究证实LINC00839 可通过靶向抑制miR-519d-3/JMJD6 轴 表 达，促 进 肺 癌 细 胞 增 殖［17］。目 前LINC00839在BC中的表达及相关意义尚不清楚。

本研究结果显示，与癌旁正常组织相比，LINC00839 在BC 组织过表达，在T24、5637、EJ 细胞中，5637细胞LINC00839表达最高，提示LINC00839可能与BC 发生发展密切相关。本研究将3 条si-LINC00839 干扰序列转染BC5637 细胞，qPCR 检测结果显示，si-LINC00839-2组抑制效率最佳，选其作为研究干扰序列。与si-NC 组相比，si-LINC00839-2 组转染后，细胞增殖和侵袭力下降，凋亡率增加，提示LINC00839 在BC5637 细胞中发挥促癌作用，沉默其表达可抑制其增殖及侵袭等恶性生物学行为。

miRNA 是LncRNA 作用靶标，调控下游基因的表达，影响肿瘤发生发展进程［18-19］。本研究前期研究已证实EDNRB 是miR-124-3p 的潜在靶基因。EDNRB是内皮素-1（ET-1）的一种G蛋白偶联受体。ET-1 和EDNRB 的结合被称为内皮素轴，与细胞增殖、迁移和凋亡相关。ET-1 是由21 个氨基酸组成的多肽，广泛参与细胞增殖、抑制细胞凋亡、转移等恶性肿瘤相关进程，是BC、前列腺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤的相关生长因子［20-21］。

目前关于BC 细胞中，LINC00839 与miR-124-3p 的相关性研究少见。本研究进一步发现共转染LINC00839-WT 和miR-124-3p mimics 后，BC5637细胞荧光素酶相对活性降低，提示LINC00839 存在miR-124-3p 结合位点，沉默LINC00839 可促进miR-124-3p 的表达上调，下调EDNRB 蛋白表达。提示在BC 细胞中干扰LINC00839，可通过上调miR-124-3p 表达后抑制EDNRB 蛋白，从而影响BC细胞增殖、侵袭等恶性生物学功能。

综上所述，LINC00839在BC组织和细胞中过表达，沉默LINC00839可抑制BC5637细胞增殖及侵袭等恶性生物学行为，机制可能与上调抑癌因子miR-124-3p 有关。本研究仅初步探讨LINC00839 调控miR-124-3p 对BC 细胞恶性生物学行为的影响，该结论未在动物体内进行验证，是否还有其他信号通路参与，将是下一步研究的重点内容。