人骨髓间充质干细胞来源外泌体分离、鉴定及卵巢摄取

杨雨涛，王袁，谢嘉欣，付霞霏

骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cell，BMSC）为一种成体干细胞，因其自我更新、诱导分化等特点，对神经系统等疾病有治疗作用［1］。外泌体（exosome，Exo）是一种直径为30~150 nm 的细胞外囊泡，可传递蛋白质、脂质和核酸，具有靶向细胞功能，是间充质干细胞发挥作用的重要途径［2-3］。研究已证实Exo 在心脏、骨等相关疾病及再生方面发挥重要作用［4-6］。颗粒细胞是卵巢的基础功能单位，位于卵母细胞透明带外侧，支持卵母细胞生长、发育和成熟［7］。早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是一种常见的妇科内分泌疾病，4%~30%POI 的发生有自身免疫失调参与［8］。研究发现，颗粒细胞中Epg5基因表达失调可以导致POI发病，可见颗粒细胞异常在POI发生发展中起关键作用［9］。目前研究多集中于干细胞治疗自身免疫性POI，但人骨髓间充质干细胞（human bone mesenchymal stem cell，hBMSC）来源Exo治疗自身免疫性POI相关研究甚少。本研究通过提取hBMSC来源Exo，观察人卵巢颗粒细胞（KGN）及自身免疫性POI小鼠卵巢组织摄取Exo的情况，为探索该Exo治疗自身免疫性POI的生物学作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 3 只SPF 级雌性BALB/c 小鼠（7~8 周龄），体质量18~22 g，均购自南方医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（粤）2020-0052。小鼠均在适宜温度（30±2）℃和光照周期（14 h 光照/10 h 黑暗）下自由摄食饮水。

1.1.2 主要试剂与仪器 hBMSC 由南方医科大学珠江医院再生医学研究所提供；KGN 细胞购自广州捷威斯生物公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自上海依科赛生物公司；DiR 染料购自苏州宇恒生物公司；CD63 兔单克隆抗体购自英国Abcam 公司，CD9、肿瘤易感基因（TSG）101 兔单克隆抗体购自华安生物公司；羊抗兔抗体购自康为世纪生物公司；ZP3蛋白多肽购自中国捷威生物科技公司；荧光倒置显微镜、共聚焦显微镜（德国莱卡公司）；纳米流式仪（厦门福流公司）；低速离心机（德国Eppendorf公司）；高速冷冻离心机、超高速冷冻离心机、透射电镜（日本日立公司）；超灵敏度化学发光成像系统（美国Bio-Rad 公司）；IVIS Spectrum 小动物活体光学成像系统（上海PerkinElmer公司）。

1.2 方法

1.2.1 无Exo FBS制备 将普通FBS于1×105r/min，4 ℃超高速离心12 h，得到上清液，用0.22 µm 滤膜过滤后得到无Exo FBS。

1.2.2 hBMSC 及KGN 细 胞 培 养 hBMSC 及KGN 细 胞 均 于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。取P3 至P9 代hBMSC，加入完全培养基培养细胞，当其生长至70%~80%时，更换培养基，PBS 清洗，用无Exo FBS 与DMEM/F12 配制成10%无Exo完全培养基继续培养48 h，收集上清液于-80 ℃冰箱冷冻储存。取P4代hBMSC，在倒置显微镜下观察细胞形态。

1.2.3 超高速离心法提取Exo 将冻存的细胞上清液于4 ℃过夜融化，在4 ℃下以2 000 r/min离心20 min，去除细胞碎片等沉淀物，再在4 ℃下以10 000 r/min离心30 min去除亚细胞成分，然后以1×105r/min 超离心90 min 得到沉淀物，尽可能完全清除上清液，将每管中的沉淀重悬于PBS中，以1×105r/min超离心90 min，得到的最终沉淀物即为Exo。

1.2.4 纳米流式仪测Exo粒径 将分离到的Exo待测样本用1 mL经过滤的PBS混匀，按照纳米流式仪说明书缓慢注入机器进行上样，检测粒径。

1.2.5 透射电镜（transmission electron microscope，TEM）观察Exo形态 将Exo样本交由广东省科学院微生物研究所检测其形态。吸取Exo样品滴于铜网上，2 min后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体。滴加3%磷钨酸（pH=7.0）于铜网，2 min后用滤纸从铜网边缘吸去多余染液。滴加纯水于铜网，用滤纸从铜网边缘吸去多余水，待干后用于TEM观察。

1.2.6 Western blot 检测Exo CD63、CD9、TSG101 膜蛋白表达 BCA 法测定Exo 蛋白浓度，将Exo 蛋白样品经SDSPAGE 电泳、转膜、封闭，加入CD63（1∶1 000）、CD9（1∶500）、TSG101（1∶1 000）单克隆抗体4 ℃过夜孵育，室温摇床孵育二抗90 min。在膜上滴加适量ECL化学发光液，通过化学发光成像系统分析蛋白表达。

1.2.7 Exo 荧光标记 按照DiR 说明书的步骤进行操作。hBMSC-Exo悬液中加入50µmol/L DiR在37 ℃孵箱中避光孵育30 min。然后加入一定量的PBS液重悬，1×105r/min，4 ℃，超高速离心70 min，弃掉上清液，使已标记的Exo与未结合的DiR染料分离。

1.2.8 共聚焦显微镜观察Exo 内化 将KGN 细胞种板在共聚焦小皿中，加入20 mg/L DiR标记的Exo，避光，37 ℃共孵育24 h 或48 h。然后PBS 轻柔清洗2 次，加入1 mL 4%多聚甲醛溶液固定5 min，PBS 清洗3 次，每次5 min。加入DAPI 染料，避光孵育5 min，PBS清洗3次，每次5 min。最后加入50µL抗荧光淬灭封片剂，避光，通过共聚焦显微镜观察KGN细胞能否摄取Exo（KGN 细胞核周围有红色荧光即DiR 标记的Exo）及摄取量。

1.2.9 活体成像观察POI 小鼠摄取Exo 将ZP3 蛋白多肽（NSSSSQFIHGPR）以1 g/L溶解于蒸馏水，再将其乳化成等体积的完全弗氏免疫佐剂（complete Freund's adjuvant，CFA）和不完全弗氏免疫佐剂（incomplete Freund's adjuvant，IFA）。在所有小鼠后脚和腹部皮下注射0.15 mL 含75µg ZP3 多肽的CFA乳剂。14 d后用0.15 mL含75µg ZP3多肽的IFA乳剂在相同部位进行第2次皮下注射。第2次免疫6周后，小鼠出现动情周期不规则或延长的现象，提示成功建立自身免疫性POI 小鼠模型。建模后第1 天，小鼠腹腔注射150µg DiR 标记的Exo；建模后第7 天，再次腹腔注射150 µg DiR 标记的Exo。在第2次注射Exo后的第14天，通过活体成像仪观察小鼠摄取Exo的情况。

2 结果

2.1 hBMSC细胞形态 hBMSC在达到80%~90%汇合后呈纺锤状，大小均一，贴壁良好，见图1。

Fig.1 The morphology of hBMSC(×400)图1 hBMSC的形态（×400）

2.2 Exo 粒径及形态分析 所提取出的Exo 平均直径为（81.12±17.23）nm，与Exo粒径范围（30~150 nm）相符合，见图2。TEM 下可见Exo 呈典型的双层膜状，见图3。

Fig.2 The particle size of hBMSC-derived Exo图2 hBMSC来源Exo的粒径

Fig.3 The morphology of hBMSC-derived Exo(The scale is 100 nm)图3 hBMSC来源Exo的形态（比例尺为100 nm）

2.3 Exo中CD63、CD9、TSG101膜蛋白表达 CD63、CD9和TSG101膜蛋白在hBMSC来源Exo中呈阳性，见图4。

Fig.4 Expression of CD63,CD9 and TSG101 membrane proteins in Exo图4 Exo中CD63、CD9、TSG101膜蛋白表达

2.4 KGN 细胞摄取Exo 情况 与共孵育24 h 相比，共孵育48 h 的细胞核周围红色荧光强度更强，摄取Exo量更多，见图5。

2.5 小鼠卵巢组织摄取Exo 活体成像仪观察到3只小鼠卵巢部位有发光信号，通过腹腔注射，Exo可被小鼠卵巢组织摄取，见图6。

3 讨论

近年来，随着更多标准化的纯化和分析程序的开发，BMSC 来源Exo 的提取效率得到提高，在疾病治疗中受到广泛关注及应用［10-11］。POI 严重威胁女性的生殖健康和生活质量，免疫因素是其常见病因，目前缺乏有效治疗方法，临床上以激素补充等对症治疗为主，但达不到满意的疗效。相较于干细胞而言，MSC 来源的Exo 具有低免疫原性、低恶性潜能、易于储存和移植等优点，在POI治疗中受到关注［12］。本研究通过超高速离心提取hBMSC 来源Exo，观察到KGN 细胞及自身免疫性POI 小鼠卵巢组织摄取Exo，提示hBMSC来源Exo有望成为治疗自身免疫性POI的新思路。

Rhim 等［13］应用ZP3 诱导小鼠出现自身免疫性卵巢炎，类似于人类自身免疫性POI，此后大量学者均采用该方法构建免疫性POI 模型进行实验研究。本课题组经多次实验验证，建模后的模型动物在卵巢组织结构和功能上均与人类自身免疫性POI表现相似，拟合度及成功率较高，因此选用ZP3多肽构建自身免疫性POI动物模型。自1980年Exo在网织红细胞成熟过程中首次被分离出后，越来越多研究证明，大多数细胞如间充质干细胞、B 细胞、T 细胞、上皮细胞、内皮细胞及少突胶质细胞等均可释放Exo［6］。本研究通过超速离心法得到纯度较高的hBMSC 来源Exo。Exo 的分离和纯化方法包括超速离心法、超滤法、尺寸排斥色谱法和基于微孔板的磁免疫捕获法［14-15］。虽无统一鉴定标准，但超速离心法在不同的研究中均被证明有效，且其分离Exo 纯度和回收率高，同时最大限度减少蛋白质聚集体和其他膜粒子的共纯化，有利于保护Exo的功能，是目前分离提纯Exo的主要技术［16］。

Fig.5 The uptake of hBMSC-derived Exo by KGN cells observed by confocal microscopy图5 共聚焦显微镜观察KGN细胞摄取hBMSC来源Exo

Fig.6 Exo uptake in ovarian tissue observed by fluorescence imaging in vivo图6 活体荧光成像观察卵巢组织摄取Exo

BMSC 作为最经典的间充质干细胞，取材方便，易分离培养。BMSC 分泌的Exo 可携带多种物质如蛋白、miRNA 及脂类等，抑制外周血单个核细胞分泌干扰素γ，并具有免疫调节、组织修复刺激、迁移、增殖、抗炎和抗氧化作用［17］。在体外，鼠源BMSCExo 可被化疗损伤的颗粒细胞内吞，抑制颗粒细胞凋亡；在化疗导致的卵巢早衰模型中，小鼠卵巢原位注射Exo 后可促进卵巢内血管生成，改善小鼠的卵巢结构和功能［18］。本研究中KGN 细胞成功摄取了hBMSC 来源Exo，且与共孵育24 h 相比，48 h 的摄取量更多，初步说明Exo 能被体外细胞摄取，且Exo 摄取量与共孵育时间也有一定关系。在免疫性POI小鼠体内观察到腹腔注射Exo 后其卵巢组织摄取Exo的现象，证明Exo可到达小鼠卵巢组织，被卵巢组织摄取内吞，但还需进一步明确hBMSC 来源Exo 在自身免疫性POI的治疗作用及其机制。

在体内，不同的注射方式会影响Exo 摄取。动物体内注射Exo 常用方法有尾静脉、腹腔及原位注射，其中尾静脉注射较为常用。静脉注射Exo在肝、脾和肺中富集，容易导致静脉堵塞，被血液中的巨噬细胞清除掉，影响Exo 到达靶器官从而减弱治疗作用。腹腔注射Exo 可形成更分散的分布模式，且在内脏脂肪组织中可观察到明显的Exo积累［19］。与静脉或腹腔注射Exo相比，原位注射Exo虽然可减少脱靶递送并增加靶组织的暴露并减少Exo 的清除［20］，但其更具有创性，易造成动物的大量失血或感染甚至死亡。在Exo治疗化疗致POI的研究中，多数研究者采用尾静脉注射方式进行体内动物实验［18，21］，极少数会采取原位卵巢注射及腹腔注射方式［22-23］。本研究采取腹腔注射Exo的方式，观察到Exo在第2次注射后的第14天可以归巢到小鼠卵巢中，证明腹腔注射的可行性。

综上所述，本研究顺利分离提纯出hBMSC来源Exo，并观察到KGN细胞及自身免疫性POI小鼠卵巢组织能够摄取Exo，为相关研究者提供参考。