中性粒细胞胞外诱捕网在冠心病进展中的作用及机制研究

覃思润 盛喆 陈晨阳 詹耀坤 曹宇

[基金项目：国家自然科学基金资助项目（82000300）

通信作者：曹宇，E-mail：caoyu0811@csu.edu.cn]

【摘要】中性粒细胞是人体免疫系统的主要成分之一，在抵御感染和炎症过程中扮演着重要角色。近年来，研究表明中性粒细胞除了其传统的作用外，还能通过释放胞外诱捕网的形式参与到冠心病等多种疾病的发生和发展中，越来越多的证据表明中性粒细胞胞外诱捕网在冠状动脉粥样硬化的进程中也起到关键性作用。因此，干预中性粒细胞胞外诱捕网的形成和释放可能是治疗冠状动脉粥样硬化及其并发症的新策略。目前，针对中性粒细胞胞外诱捕网的干预已成为研究的热点，未来，针对中性粒细胞胞外诱捕网的干预可能成为冠心病治疗的新方向之一。现就中性粒细胞胞外诱捕网在冠心病发生发展中的作用机制及其应用前景进行综述。

【关键词】中性粒细胞胞外诱捕网；冠心病；动脉粥样硬化；血栓形成

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2023.12.000

The Role and Mechanism of Neutrophil Extracellular Traps

in the Progression of Coronary Heart Disease

QIN Sirun，SHENG Zhe，CHEN Chenyang，ZHAN Yaokun，CAO Yu

（Department of Cardiovascular Medicine，The Third Xiangya Hospital，Central South University Changsha，Changsha 410013，Hunan，China）

【Abstract】Neutrophils are one of the main components of the body's immune system and play an important role in defending against infection and inflammation. In recent years， studies have shown that in addition to its traditional role， neutrophils can also participate in the occurrence and development of a variety of diseases， including coronary heart disease， through the release of extracellular traps， that is， more and more evidence that neutrophils extracellular traps also play a key role in the process of coronary atherosclerosis. Therefore， intervening in the formation and release of neutrophil extracellular traps may be a new strategy for the treatment of coronary atherosclerosis and its complications. At present， the intervention of neutrophil extracellular trap has become a research hotspot， and in the future， the intervention of neutrophil extracellular trap may become one of the new directions of coronary heart disease treatment. This article reviews the mechanism and application prospect of neutrophil extracellular trap in the occurrence and development of coronary heart disease.

【Key words】Neutrophil extracellular traps；Coronary artery heart disease；Atherosclerosis；Thrombosis

激活的中性粒細胞（polymorphonuclear neutrophils，PMN）除经典的吞噬作用外，还可在细胞外释放染色质、核蛋白和丝氨酸蛋白酶，形成一种名为中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）的网状结构，并以此捕获和杀死致病菌，最初被认为是人体抗感染的重要防御机制。随后研究表明，NETs在人类自身免疫性疾病、癌症、慢性阻塞性肺疾病、高血压等病症的发病机制中，同样具有重要意义。NETs可促进内皮细胞功能障碍及凝血系统激活，成为炎症、氧化应激、先天免疫、血栓形成的重要调节剂。冠状动脉粥样硬化是一种脂质驱动的动脉管壁长期渐进性炎性疾病，其持续进展可导致管腔狭窄，进而发生冠心病及急性冠脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）。现冠心病发生率逐渐上升，并呈年轻化趋势，成为当今世界危害人体健康的第一大杀手。Borissoff等[1]研究发现，循环NETs生物标志物与冠状动脉粥样硬化斑块大小呈正相关，且与冠心病的临床严重程度和主要不良心脏事件的发生率密切相关。NETs可作为预测冠心病的严重程度、ACS发生风险、心肌梗死面积及血运重建后慢血流事件的生物标志物。既往大量研究将NETs与ACS事件联系在一起，但目前研究证明NETs或许存在于冠状动脉粥样硬化进展的各个时期，在动脉粥样硬化进展早期以NETs为靶点予以干预可发挥抗炎及抗凝作用，从而有效缓解疾病进展。

1  NETs在动脉粥样硬化进展中的作用

多项研究证明NETs存在于人类和动物模型的动脉粥样硬化病变的各个阶段中，并与导致动脉粥样硬化形成的各种机制有关。

内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化早期的表现[2]，单核细胞向受损内皮细胞黏附并转移至内皮下且进一步分化成巨噬细胞吞噬脂质，演变成为泡沫细胞形成脂质条纹[3]。除单核细胞外，近年来，PMN在致动脉粥样硬化进展中的作用受到学界关注。在早期阶段，PMN主要是通过释放危险信号分子如抗菌肽37，诱导内皮细胞表达细胞间黏附分子1和单核细胞趋化蛋白1募集大量巨噬细胞[4]；其次，PMN诱导巨噬细胞向M1型和泡沫细胞转化，泡沫细胞可产生活性氧并诱导炎症反应，促进动脉粥样硬化进展；最近有研究[5]表明，在系统性红斑狼疮患者血管中，NETs包含的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）9将内皮细胞包含的前MMP-2活化为MMP-2并与之结合，而后引起血管内皮细胞损伤（图1）。

待病变进展至晚期，斑块常显示出强大的不稳定性及继发的血栓形成倾向，其中不稳定斑块又以薄的纤维帽、大的坏死核心及血管微钙化、斑块内微血管形成为特征[6-9]。Ionita等[10]等观察到不稳定斑块中存在大量的PMN浸润。凋亡的PMN聚集并通过释放MMP裂解促胞葬刺激性信号分子，从而抑制巨噬细胞耦联的胞葬过程[11]，无法被及时清除的凋亡细胞堆积及继发性坏死，加剧坏死核心的形成和生长；平滑肌细胞与PMN的相互作用诱导NETs形成，NETs中的髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）产生的活性氧可提高胶原酶（MMP-2、MMP-9、MMP-14）活性，增强炎症细胞的募集和细胞外基质的降解[12]；组蛋白H4则会降解平滑肌细胞从而导致纤维帽变薄，斑块失稳。使用抗组蛋白H4抗体治疗小鼠可有效抑制小鼠平滑肌细胞凋亡[13]。另外，研究表明，NETs可激活动脉粥样硬化病变中的浆细胞样树突状细胞的自身免疫，从而引起Ⅰ型干扰素（interferon-I，IFN-Ⅰ）大量合成释放[14]，而IFN-Ⅰ的信号通路在破裂斑块中上调，进而加剧病损部位平滑肌细胞凋亡及坏死核心的形成[15]。对小鼠模型使用氯脒药物治疗后可观察到斑块体积的减小和颈动脉血栓形成的延迟，然而在缺乏IFN-Ⅰ受体的小鼠模型中治疗无效[16]，由此证明IFN-Ⅰ在介导动脉粥样硬化的NETs反应中的重要作用（图2）。

综上所述，NETs主要通过加强机体动脉粥样硬化的免疫及炎症反应促进其进展。尽管学者们进行大量的临床和实验研究，证实NETs介导动脉粥样硬化不同时期的发展机制，但现阶段的研究仍存在一些尚待阐明的疑问，例如与凋亡细胞不同，不表现“食我信号”的NETs的被清除机制目前仍未可知[17]；中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）可降解胶原及纤维蛋白，使纤维帽变薄，并与不稳定斑块具有相关性[6]。NE能否作为预测ACS事件的生物标志物仍需进一步研究；PMN导致冠状动脉钙化病变的潜在上游机制以及调控钙化斑块类型间相互转化的分子机制尚待研究，仍需进一步探索加以明晰。

2  NETs与ACS

冠状动脉粥样硬化进展到一定程度，易损斑块发生破裂或侵蚀继发血栓形成是大多数ACS发病的主要病理学基础。其中导致血栓形成最常见的三大机制分别为斑块破裂、斑块侵蚀和钙化结节[18]。

ACS患者血清中增長的PMN数量和紊乱免疫调节为NETs的发生发展提供良好的生理条件。多项临床研究证实，在ACS患者血管中提取的血栓及循环中均显示较正常人群更高水平的NETs生物标志物[19]，提示NETs的形成与ACS事件的发生显著关联。一项针对ST段抬高型心肌梗死（ST-elevated myocardial，STEMI）患者的研究表明，血栓内较重负荷的NETs和脱氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonucleaseⅠ，DNaseⅠ）的活性与更大的梗死面积和抬高的ST段延迟回落有关[20]，用于评估微血管阻塞的心脏磁共振实时成像显示，随着血清双链脱氧核糖核酸的增加，STEMI患者可能发生微血管阻塞，DNaseⅠ联合重组组织型纤溶酶原激活物可通过阻断NETs诱导的微血栓形成，在心肌缺血再灌注损伤诱导的心肌“无复流”中具有治疗潜力[21]。Riegger等[22]则表明NETs存在于1/4的经皮冠状动脉介入治疗后支架内血栓形成样本中，是支架内血栓形成的标志。现在越来越多文献都表达一个观点：PMN、血小板、NETs三者之间存在着与凝血相关的作用。研究表明，来自心肌梗死患者的NETs携带组织因子，一旦暴露在血液中便会触发凝血级联反应，导致凝血酶的产生，进一步激活血小板[23]；NETs的成分本身也可促进凝血因子的基因表达，如血管性假血友病因子和纤维蛋白原，后者可转化为纤维蛋白，促进血栓前分子的积累；另外，NETs还可捕获循环中的血小板、纤维蛋白链和血管性假血友病因子，构成血栓形成的支架，具有稳定血栓的作用[24]。目前冠心病的主要治疗措施包括抗血小板和抗凝，但随之而来的药物不良反应包括各种出血事件的发生。当前新型抗血栓疗法，如DNaseⅠ通过降解NETs加速血栓的溶解而不以增加患者的出血风险为代价，从而在抗血栓和出血事件间达到平衡，为冠心病二级预防及心肌梗死后治疗提供新思路。

斑块破裂是ACS发生的首要机制[18]。斑块破裂后释放大量胆固醇结晶，上调促炎细胞因子及趋化因子的表达，这一无菌性炎症反应通过募集PMN诱导NETs形成，同时NETs携带的活性组织因子进一步表达，促进破裂斑块处血栓的形成并通过PAR信号通路激活血小板导致血栓的扩大，进而影响病变进展[25]。区别于斑块破裂，约31%的ACS患者是由斑块侵蚀导致的，其病理特征为斑块表面内皮细胞的剥脱，纤维帽呈完整状态，管腔狭窄程度较轻。2018年研究急性心肌梗死患者罪犯和非罪犯斑块中NETs的浸润及分布情况，结果PMN和NETs大量存在于所有罪犯斑块中，但在斑块破裂、斑块侵蚀和斑块内出血三者之间无显著差异性[26]，但随着研究的深入发现，NETs其实与斑块侵蚀更为相关，其机制被认为是PMN和NETs可通过Toll样受体2机制诱导氧化应激和内皮细胞剥脱，并分泌白细胞介素-8来募集PMN，形成正反馈效应放大内皮损伤，导致随后的血栓形成[22]。这提示NETs在斑块侵蚀中可能发挥更重要的作用。目前临床上不论病理机制，STEMI患者一律采用经皮冠状动脉介入治疗，然而2018年的EROSION研究[27]提出对于斑块侵蚀所致的ACS患者，在狭窄程度较轻、血流较好的情况下，可采用规律强化的双联抗血小板治疗稳定病情从而避免支架植入后的一系列并发症，将NETs及其相关成分作为靶点开发相应的治疗用于斑块侵蚀的患者，或许可为其提供一种新颖的治疗手段。

3  NETs与稳定性冠心病

研究[28]表明，NETs的相关组成成分可作为冠心病的生物标志物，在稳定性冠心病中可作为预测动脉粥样硬化疾病严重程度和未来心血管事件风险的诊断工具。双链脱氧核糖核酸、MPO-DNA复合物、瓜氨酸组蛋白H3、核小体或NE以及其他NETs成分在血浆中的存在并以其独特的方式在冠心病中扮演着不同的角色。核小体的血浆水平被发现是严重冠状动脉狭窄的独立替代指标，MPO-DNA复合物的浓度与病变血管的数量正相关，并可预测主要不良心脏事件的发生。既往大多数研究着眼于动脉粥样硬化晚期或ACS患者中NETs的表达，对于早期及稳定性冠心病患者中NETs的临床研究尚缺乏。稳定性冠心病患者比ACS患者更容易检测到分层斑块，其代表频繁发生的亚临床血栓形成，Langseth等[29]在检测稳定性冠心病患者循环中NETs生物标志物时发现，慢性NETs活动的存在可能与亚临床血栓形成事件及稳定性冠心病的不良结局相关，笔者推测慢性NETs活动与斑块反复的亚临床破裂和修复相关，及分层斑块可能观测到更强的NETs活动，导致斑块的快速进展[29]。

4  冠心病中针对NETs的治疗靶点

NETs的发现填补了PMN在免疫浸润与心血管疾病上的空白，NETs也应被视为有吸引力的治疗靶点。PMN特异性酶如MPO、肽基精氨酸脱亚氨基酶（peptidyl arginine deiminase type IV，PAD4）和NE在NETs的形成中起着关键作用。经证实缺失PMN特异性酶的小鼠将不能产生或仅产生不完全的NETs。目前，已开发出BMS-P5、GSK484、GSK199、CL-脒等PAD4抑制剂和PF-1355、PF-06282999、INV-315、AZD5904等MPO抑制剂，它们可能通过阻断NETs形成，在NETs病理损伤性疾病的治疗中具有潜在作用。但是，NETs抑制剂在冠状动脉粥样硬化进程中是否发挥治疗作用，其相关副作用如何，仍有待于进一步大样本研究证实（表1）。

冠心病的二级预防策略包括抗血小板、调脂、稳定斑块，血小板活化对于血小板介导的NETs是必不可少的，如临床上广泛使用的阿司匹林可间接抑制NETs的形成，延缓动脉粥样硬化进展。另外，抗凝剂肝素能像DNaseⅠ一样有效地拆除NETs支架，证明抗血小板、抗凝药物通过抑制NETs在冠心病中的治疗机制。既往研究[35]证明口服凝血因子X（Coagulation Factor X，FX）抑制剂利伐沙班在稳定性冠心病的获益，在稳定性冠心病患者中，与单抗相比，阿司匹林中加入利伐沙班2.5 mg每日两次显著降低动脉粥样硬化主要结局、心血管死亡和全因死亡的风险。另一研究[36]发现，FX因子的Gla结构域在NETs形成期间介导FX因子与活化的PMN的结合中起重要作用，二者结合后形成NETs-FX复合物，较FX因子具有更强的促凝血功能。以上两项研究表明，利伐沙班或许可通过阻断FX因子与NETs形成的正反馈机制，且阻断NETs-FX的强化凝血功能从而达到冠心病获益（图3），从而为其在稳定性冠心病中的運用提供依据。

注：①，FX因子通过活化中性粒细胞促进NETs形成过程；②，NETs能捕获FX因子形成NETs-FX复合物，较FX因子具有更强的促凝血功能；③，利伐沙班通过抑制FX因子打断凝血与NETs形成的正反馈效应，且阻断NETs-FX的强化凝血功能。

图3  利伐沙班通过阻断NETs与FX因子的正反馈机制在冠心病中发挥保护作用

5  总结

综上所述，NETs是PMN释放的一种网状杀菌结构，它在冠心病进展中扮演着重要的角色，其能引发内皮细胞功能障碍及促进凝血系统激活，在炎症和氧化应激之间均能进行有效调节，而冠心病的发生与动脉管壁长期渐进性炎性疾病息息相关。NETs存在于冠状动脉粥样硬化进展各个时期，与动脉粥样硬化的形成有重要关联。冠状动脉粥样硬化进展到一定程度，易损斑块发生破裂或侵蚀继发血栓形成，是ACS发病的主要病理学基础，在ACS患者血管中提取的血栓以及循环中均显示较正常人群更高水平的NETs生物标志物。NETs相关组成成分可作为冠心病的生物标志物，在稳定性冠心病中可作为预测动脉粥样硬化疾病严重程度和未来心血管事件风险的辅助诊断工具，慢性NETs活动与斑块反复亚临床破裂和修复相关，且分层斑块能观测到更强的NETs活动，导致斑块快速进展。然而，NETs或是一把双刃剑。它不仅可促进内皮细胞功能障碍和凝血系统激活，导致严重的心血管事件，还能诱导梗死区巨噬细胞向M2极化并促进心肌细胞的愈合。同时，PMN也是人体抵御病原体侵袭的第一道防线。对于正常人群，NETs被释放出以发挥其捕捉和杀死病原体的免疫效能。因此，直接影响PMN功能的治疗方法有可能会削弱机体的防御系统，谨慎使用NETs抑制剂，以避免削弱机体的防御系统。因此，NETs与冠心病进展密切相关，对其进行深入研究将有助于全面理解冠状动脉粥样硬化的发生机制和冠心病的防治。未来需要找到最佳治疗策略，既不会削弱机体的免疫防御系统，又能有效地降低冠心病的风险，以造福于冠心病患者。

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收稿日期：2023-03-16