微生物菌剂在牡丹籽粕堆肥工艺中的应用

吴永玲 程敏 孟银凤

摘 要：通过单因素试验结合响应面试验，对牡丹籽粕堆肥工艺条件进行优化，研究C/N、芽胞杆菌R及基础功能菌EM菌对堆肥效果的影响，以牡丹籽堆肥的总养分含量为评价指标，确定牡丹籽粕在微生物菌剂作用下的最优堆肥工艺参数。同时参考有机肥料标准，分析最佳复配条件下pH、温度、电导率、纤维素含量等堆肥参数的变化。结果表明，C/N为27、R菌加菌量为2.1%、EM菌加菌量为2.4%时，所得有机肥的肥效最优。响应面回归模型交互作用中R菌和EM菌加菌量对牡丹籽粕堆肥效果影响极显著。最佳复配条件下堆肥理化参数均优于对照（清水）。

关键词：牡丹籽粕；响应面法；微生物菌剂；堆肥

中图分类号：S141.4    文献标识码：Ａ     文章编号：1674-0033（2023）02-0045-08

引用格式：吴永玲，程敏，孟银凤.微生物菌剂在牡丹籽粕堆肥工艺中的应用[J].商洛学院学报，2023，37（2）：45-52.

Abstract： Single factor test combined with response surface method to optimize the composting process conditions of peony seed meal， and the effects of C/N， Bacillus R and basic functional bacteria EM on the composting effect were studied. The composting process parameters of meal were studied and the changes of composting parameters were analyzed such as pH， temperature， electrical conductivity and cellulose content under the optimal compounding. The results showed that when C/N was 27， R bacteria with 2.1%， and the EM bacteria with 2.1%， the fertilizer efficiency of the obtained organic fertilizer was the best. The composting effect was significantly affected by the amount of bacteria R and EM; the composting process parameters under the optimal compounding conditions were better than the water control group.

Key words： peony seed meal; response surface methodology; microbial inoculum; compost.

牡丹作為商洛中药产业重点发展“十大商药”之一，因牡丹籽含油率高，且富含多种不饱和脂肪酸，油用牡丹已成为我国多省区广泛种植的一类特色作物，其中商洛市商南县等地近年来新增种植面积超过0.2万hm2 [1]，同时牡丹籽粕被大量废弃，造成资源浪费及环境污染[2-3]。牡丹籽粕中含有丰富的芍药苷、多糖等药用成分[4-6]，因此提高牡丹籽粕的利用率，为牡丹产业精深化发展提供思路。

好氧堆肥是堆肥化处理中微生物通过分泌多种酶对有机物进行分解和转化，同时释放大量的热，并使发酵底物被快速降解，最终实现发酵底物的资源化利用[7-9]。目前，用于堆肥的主要原料是农业废弃物（包括餐厨垃圾、稻壳、秸秆和中草药渣等）、畜禽粪便及城市有机固体废弃物（枝叶、污泥等）等[10-12]。本研究以牡丹籽粕为原料，稻草秸秆为调节填充剂进行堆肥发酵，对其堆肥进程中理化参数进行测定，同时以堆肥的总养分含量为评价指标，选取对堆肥效果影响显著的因素和微生物菌剂进行响应面试验，确定堆肥的最优工艺参数，以期为牡丹籽粕堆肥工艺优化提供一定的理论依据。

1  材料与方法

1.1 材料

牡丹籽粕来自陕西君威农贸综合有限责任公司，试验前烘干后粉碎；稻草秸秆采自商州区农田剪成长约5 cm的小段，为调节填充剂。

微生物菌剂：R菌来源于商洛学院生物医药与食品工程学院微生物实验室分离所得芽胞杆菌属，对残渣具有较高的降解能力；EM菌（主要含有酵母菌、蓝细菌、乳酸菌及枯草芽孢杆菌）来源于北京康源绿洲生物有限公司，作为基础功能菌可快速降解糖类等物质。上述两种菌均为粉剂。

1.2 方法

1.2.1单因素试验

通过文献调研及前期试验，在含水率为60%的条件下，把C/N为27、2.0%R菌添加量、2.0%EM菌添加量设定为基础水平，采取单因素试验研究不同C/N（21，24，27，30，33）、R菌添加量（1%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%）、EM菌添加量（1%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%）三个因素对堆肥工艺的影响。研究其中一个因素的影响时其他因素水平为基础水平，将复配菌系加入堆肥原料中，以堆肥的总养分含量为评价指标，研究每个因素对堆肥工艺的影响。

1.2.2响应面试验

综合单因素试验结果，采用Box-Behnken设计试验，以C/N、R菌添加量、EM菌添加量为三个变量，以堆肥的总养分含量为响应值进行三因素三水平响应面试验设计（如表1），利用Design-Expert.V8.0.6软件分析数据，得出堆肥的最优工艺参数。

1.2.3牡丹籽粕堆肥的方法

堆肥原料均为30 kg，堆置于带孔（Φ=1 cm）箱中，堆体建立当天记为第0天，发酵至40 d。采用人工翻堆的方式，当堆体温度下降时进行翻堆，前两周每2 d翻堆一次，两周后每5 d翻堆一次，同时根据含水率补给水分。处理样（T）为添加微生物菌剂，对照样（CK）不添加微生物菌剂，各设三次重复。

1.2.4牡丹籽粕堆肥过程样品的采集

堆置期间，每日测定堆肥中心及环境温度；于0，5，10，17，27，40 d进行多点取样，以堆体中心为原点，在10 cm半径内从堆体左、中、右三处各采集样品100 g，置无菌密封塑料袋中用于堆肥理化性质的测定。取样时记录堆肥的气味、颜色等物理性状。

1.2.5牡丹籽粕堆肥中理化参数的测定

1）气味与色度

采用人工判别方法（4人以上）分别定性判定发酵堆体的感官性状（包括堆体颜色、气味、颗粒度）[13]。

2）温度测定

采用热电偶温度计，每2 d分别测定堆体中心、距中心的左及右各10 cm堆体温度，计算温度平均值。

3）含水率测定

采用失重法测定含水率。将装有鲜样的培养皿敞口放入电热恒温鼓风干燥箱中，105 ℃下干燥3 h后测定失水率。

4）pH值和电导率（EC）值的测定

将鲜样与去离子水按质量体积比1：10混合后，置于37 ℃ 160 r/min震荡20 min，静置15 min，上清液即堆肥浸提液用于pH、电导率的测定。

5）纤维素和半纤维素含量的测定

将新鲜样品置于电热鼓风干燥箱中105 ℃干燥60 min，粉碎机粉碎过筛。参考卢佳伟等[14]的方法测定纤维素和半纤维素含量。

6）总养分含量的测定

总有机碳、全氮、全磷、全钾含量：参照有机肥测定标准方法（NY525-2021）测定。即全氮采用凯氏定氮法（过氧化氢-硫酸消煮），全磷采用分光光度法，全钾采用火焰光度法。总养分（N+P2O5+K2O）含量数（以烘干基计）（%）等于全氮、全磷、全钾含量相加[15]。

7）堆肥中种子发芽指数的测定

取20粒黄瓜种子，均匀放置在铺好滤纸的培养皿中，分别滴加制备０，５，１０，１７，２７，４０ d（编号分别为１，２，３，４，５，６）的处理样浸提液，加完后在上层覆盖一层滤纸。以灭菌水作为空白对照，设置三个重复，黑暗培养6 d后，分别计算种子发芽率和根长。

种子发芽指数（GI）（%）=（堆肥浸提的种子发芽率×种子平均根长）/（蒸馏水培养的种子发芽率×蒸馏水培养的种子根长）×100%[１５]。

1.2.6数据处理

运用SPSS软件和Box-Behnken软件对数据进行统计学分析。

2  结果与分析

2.1  牡丹籽粕堆肥工艺优化中的单因素试验

由图1可知，牡丹籽粕堆肥的总养分含量随C/N增加呈先上升后下降趋势。当C/N为27时，堆肥总养分含量最大，表明适宜的原料C/N使得有机肥的肥效增加。

由图2可知，当R菌加菌量大于2.0%时，堆肥的总养分含量反而下降，这可能与R菌是基礎功能菌相关，即适宜地加菌量有利于提高堆肥中微生物的活性，而当加菌量过高时，则会破坏堆肥环境中的原始菌群平衡，使得堆肥进程延缓。

由图3可知，EM菌为基础功能菌，对残渣具有较高的降解能力，其加菌量大于2.0%后，堆肥的总养分含量增加缓慢，菌量加至2.5%时，堆肥的总养分含量最多，随后逐渐下降。

因此，根据单因素试验结果结合实际生产的经济性，选择C/N为27、R菌加菌量为2.0%、EM菌加菌量为2.0%进行响应面试验。

2.2 牡丹籽粕堆肥工艺优化中响应面试验

2.2.1牡丹籽粕堆肥工艺优化中回归模型的建立及显著性检验

综合单因素试验结果，利用Box-Behnken设计法，选择Design-ExpertV8.0.6软件，以堆肥的总养分含量（Y）为响应值，建立堆肥的总养分含量与C/N（A）、R菌添加量（B）、EM菌添加量（C）之间的回归模型，对表2中响应面试验结果进行多次回归拟合，得到回归方程：Y=5.860+0.064A+0.110B+0.086C+0.032AB+0.045AC+0.022BC-0.280A2-0.320B2-0.230C2

2.2.2牡丹籽粕堆肥工艺优化回归模型中响应面交互作用分析

如表3所示，模型达极显著水平，失拟项P=0.054 9＞0.05，不显著，R2=0.995 2，变异系数CV=0.55，证明模型选择可靠，可用此模型分析和预测三个因素的变化规律。此外，由P值及方差值可得，在模型模拟范围内，影响堆肥的总养分含量程度大小为：R菌添加量＞EM菌添加量＞C/N，其中，R菌和EM菌的含量对堆肥的总养分含量影响极显著（P<0.000 1）。

将模型中的A、B和C三个因素在方差分析的基础上固定，以堆肥的总养分含量作为响应值，得出其他两个因素交互作用的模型，并绘制响应面图，得到一个理论最大值。如图4所示，响应面图投影面为等高线图，其弯曲程度反应了两因素之间的交互作用大小，可知C/N与EM菌含量交互作用对堆肥效果影响较大，同时，二次项A2、B2、C2对试验结果影响也极显著。

2.2.3最佳复配条件的确定及验证

根据响应面试验结果，可得堆肥最佳配比：C/N为27.2、R菌添加量为2.12%、EM菌添加量为2.38%，在此条件下堆肥的总养分含量的预测值为5.92%。考虑实际可操作性，将最优添加量调整C/N为27、R菌添加量为21%、EM菌添加量为2.4%，最终堆肥的总养分含量的实际值为5.9%。预测值与实测值差异较小，且此模型具有一定可靠性，表明此响应面优化法对牡丹籽粕与微生物菌剂堆肥配方的确有参考价值。

2.3 最佳复配条件堆肥理化参数的测定

2.3.1牡丹籽粕堆肥过程中样品感官品质的变化

在最佳配比条件下，堆肥初期（0 d），堆体有较强臭味。随着堆肥天数增加，堆体温度升高，产生大量的NH3，可嗅到浓烈氨臭味。堆肥后期，产生土腥味。

初期堆体色泽呈黄棕色，随着堆肥进程进行，褐色腐殖酸类物质逐渐形成，堆体变成暗褐色。堆肥最后，添加菌剂的处理样物料颜色为深褐色，对照样堆体为暗褐色。

堆肥过程中，堆体体积逐渐减小，样品由块状逐渐松散。堆肥结束后，堆肥样品均无恶臭味、松散，符合农业行业标准生物有机肥的感官要求。

2.3.2牡丹籽粕堆肥过程中温度的变化

堆肥温度是微生物活动的标志，也是表征堆肥是否腐熟的关键指标之一。堆肥发酵期间，环境温度为15～25 ℃。如图5所示，堆肥2 d时，温度均超过45 ℃。堆肥6 d时，处理样温度达最高值，高温期（>55 ℃）持续时间较长，达到无害化卫生标准要求。处理样中因添加了复合菌系，对木质纤维素降解较高效，从而表现出较高的发酵温度。18～20 d时处理样堆体温度均有不同程度地升高，在最后階段对照样和处理样温度逐渐降低，接近室温。

2.3.3牡丹籽粕堆肥过程中含水率的变化

含水率是堆肥过程的关键参数，影响到氧气摄取速率、微生物活动及堆体温度。堆肥初始物料含水率为64.3%。如图6所示，随着堆肥时间的增加，含水率逐渐降低。堆置10 d时，处理样的含水率均有较大程度地下降。进入腐熟期，含水率的下降趋势变缓，但仍持续下降。堆肥结束时（40 d），处理样堆肥含水率较对照样低。由于堆肥过程中，进行了补水管理，总体而言，处理样堆肥结束时含水率均高于农业行业标准（NY884-2012）生物有机肥的标准。

2.3.4牡丹籽粕堆肥过程中pH值和电导率（EC）的变化

如图7所示，堆肥初期，相比较对照样的pH（8.20），处理样的pＨ值（7.78～7.80）较低。发酵开始后，物料中容易被分解利用的氮源被迅速降解放出大量的ＮＨ３从而导致pH值上升，在翻堆后对照样和处理样的pH值均达到最大值，随后又都开始下降，直到发酵结束。

电导率（EC）表示堆肥浸提液中有机盐类和无机盐离子的含量变化[1７-1８]。如图8所示，微生物在堆肥过程中大分子有机物代谢产生小分子物质，使电导率随堆肥时间的增加逐渐降低。堆肥初始堆体物料的电导率为4.10 mS/cm，在升温期，电导率略有增加，后降低。在堆肥结束时，处理样的电导率高于对照样。

2.3.5牡丹籽粕堆肥过程中纤维素和半纤维素含量的变化

堆肥初始物料中纤维素和半纤维素的含量分别为42.2%和44.5%。如图9和图10所示，随着堆肥时间的增加，堆体中纤维素和半纤维素逐渐降解。在堆肥进程中，处理样的纤维素和半纤维素的含量降低的速率明显快于对照样，说明微生物菌剂的添加可促进堆体中纤维素和半纤维素的降解。

2.3.6牡丹籽粕堆肥中总养分含量的变化

堆肥中的总养分含量是评价堆肥效果的重要指标，是监测堆肥整体过程的必要参数（N+P2O5+K2O）[18-19]。如图11所示，在堆肥过程中，处理样的总养分含量呈渐增趋势。在堆肥前期，堆肥的总养分含量增长较快，后增长减缓，最终堆置40 d时，处理样的总养分含量均达到行业标准，为5.92%。这可能是接种生物菌后，堆肥温度升高，水分及有机质进一步减少，堆体质量下降较快的原因。此外，接种的功能菌可使氮磷钾元素提升，从而使得堆肥的总养分含量呈逐渐升高趋势。

2.3.7牡丹籽粕堆肥中种子发芽指数的变化

堆肥中种子发芽指数的敏感性使得堆肥毒性和腐熟度的评价变得更加可靠。其中，种子发芽指数高于70%则堆肥腐熟度达到要求[20-21]。如表４所示，处理样堆肥第１７天浸提液处理黄瓜种子的发芽指数达到最高值134.56%，此时对照样的种子发芽指数最高值为119.57%，这证实了复合菌系的接种有利于加快堆肥的发酵进程及腐熟度。处理样和对照样的种子发芽指数在整个发酵过程中均大于80%。可见，以牡丹籽粕提取残渣等纤维素为主要原料的堆肥对植物种子毒性较低。

3  讨论与结论

堆肥化过程是由微生物介导的生物化学反应过程，对于木质纤维素含量较高的有机固体废弃物如中药提取残渣、农林木质纤维废弃物等，自身微生物对这些底物的降解速度慢，导致堆肥腐熟周期长、品质低，制约了此类废弃物的堆肥化、工业化处理。通常，在堆肥处理中接种微生物复合菌剂可有效促进堆肥化物料的降解、加快堆肥进程、提高堆肥品质。邵颖等[22]通过筛选发现芽孢杆菌是堆肥过程中的优势菌，可显著提高畜禽粪便堆肥降解效率和堆肥质量。毕延刚等[23]发现堆肥中的微生物和枯草芽孢杆菌具有协同效应，可显著降低病原菌对黄瓜生长的抑制作用。可见，微生物菌剂有助于提高堆肥腐熟和肥效[24-25]。本研究以牡丹籽粕为原料，稻草秸秆为调节填充剂进行堆肥发酵，选取C/N、R菌添加量及EM菌添加量3个对堆肥效果影响显著的因素，以堆肥的总养分含量为评价指标，进行响应面试验，R菌含量和EM菌含量对堆肥效果影响极显著，这可能是由于EM菌中所含的酵母菌、枯草芽孢杆菌等可快速降解糖类、蛋白质，R菌为芽胞杆菌属，对残渣具有较高的降解能力，故有利于堆肥进行。本研究结果与前期文献调研结论一致，进一步证实了牡丹籽粕与生物菌剂联用可优化其堆肥工艺性能。此外，由于堆肥过程中不同参数间复杂的联系及发酵过程的控制手段不同，接种剂对堆肥发酵结果的稳定性还需进一步研究。

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