敏咳方对咳嗽变异性哮喘豚鼠炎性介质的影响

王琳 张晓文 罗世杰

摘 要：观察敏咳方对咳嗽变异性哮喘豚鼠血清中炎性介质含量的影响，探讨敏咳方治疗咳嗽变异性哮喘的部分机制。将豚鼠随机分为空白组、孟鲁司特钠组、敏咳方常量组、敏咳方高剂量组和模型组，采用复制咳嗽变异性哮喘豚鼠模型造模，分别给予药物治疗2周（除空白组），观察各组豚鼠咳嗽次数和血清标本中IFN-γ、IL-4和CCL11的含量。结果表明，与模型组比较，经药物干预的3组豚鼠咳嗽次数明显减少（P＜0.05），与孟鲁司特钠组比较，敏咳方高剂量组豚鼠咳嗽次数明显减少（P＜0.05）；与模型组比较，经药物干预的3组豚鼠血清IL-4和CCL11的含量下降，IFN-γ含量升高（P＜0.05）；与孟鲁司特钠组比较，敏咳方高剂量组IL-4和CCL11的含量下降，IFN-γ含量升高（P＜0.05）。敏咳方可降低咳嗽变异性哮喘豚鼠血清IL-4和CCL11的含量，升高IFN-γ含量。敏咳方通过减少炎症介质产生，抑制气道炎症，增强人体免疫力能达到治疗咳嗽变异性哮喘的效果，且高剂量敏咳方对咳嗽变异性哮喘豚鼠疗效最为显著。

关键词：咳嗽变异哮喘；敏咳方；IFN-γ；IL-4；CCL11

中图分类号：R-332文献标识码：Ａ文章编号：1674-0033（2023）02-0091-06

引用格式：王琳，张晓文，罗世杰.敏咳方对咳嗽变异性哮喘豚鼠炎性介质的影响[J].商洛学院学报，2023，37（2）：91-96.

Abstract： To observe the effect of minke Prescription on Inflammatory Mediators in Guinea Pig Cough Variant Asthma. To explore some of the mechanisms of the treatment of cough-variant asthma. Divided into 5 groups， including the control group， montelukast sodium group， the conventional dose group of MinkePrescription， the high dose group of Minke Prescription， and the model group，replicating cough variant asthma guinea pig model modeling， Guinea pig drugs were given for 2 weeks （except the control group）. The number of coughs in guinea pigs and the contents of IFN-γ， IL-4 and CCL11 in serum samples were observed. The results show that： Compared with the model group， the number of coughs of guinea pigs in the three groups treated with drug intervention was significantly reduced （P<0.05）， and compared with the montelukast sodium group， the number of coughs in the high-dose group of the sensitive cough formula was significantly reduced （P<0.05）， and compared with the model group， the serum IL-4 and CCL11 contents of the three groups of guinea pigs treated with drug intervention decreased and the content of IFN-γ increased （P<0.05）. Compared with the montelukast sodium group， the content of IL-4 and CCL11 decreased in the high-dose group of Minmu formula， and the content of IFN-γ increased （P<0.05）. Minke Prescription can reduce the serum IL-4 and CCL11 levels and increase IFN-γ content in cough-variant asthma guinea pigs. By reducing the production of inflammatory mediators， inhibiting airway inflammation， and enhancing human immunity， the effect of treating cough-variant asthma is achieved， and high-dose minke Prescription  has the most significant effect on cough-variant asthma guinea pigs.

Key words： cough variant asthma; Minke Prescription; IFN-γ; IL- 4; CCL11

咳嗽變异性哮喘（cough variant asthma，CVA）以慢性、刺激性咳嗽为主要症状，不伴有喘息等症状或体征，是一种特殊类型的哮喘，又称为咳嗽型哮喘[1]，是儿科常见病和多发病。因其发病机制与病理变化与哮喘相似，又被称为“隐匿性哮喘”。随着工业化快速发展，大气污染日益加剧，CVA发病率呈逐年上升趋势[2]。研究调查显示，中国儿童慢性咳嗽患病率为1.60%～26.42%，其中CVA占比约达41.95%[3]。CVA常在春秋季节转换时发病较多，若不及时积极治疗，则易转变为典型哮喘，病程长且易反复发作，严重影响患儿的生活质量，甚至影响患儿的性格、情绪等[4]。然而，现代医学关于CVA的发病机制仍在不断探索当中，目前研究显示，CVA 病理改变表现为多种细胞及炎性因子参与的气道炎症及气道高反应[5]，诸多炎性介质参与导致气道炎症是CVA发生的本质特征。魏环[6]指出IL-4和IFN-γ与CVA气道的慢性炎症及气道高反应性有着密切的联系。柳萍飞[7]研究发现，健康儿童血清IL-4含量低于CVA患儿，IFN-γ含量高于CVA患儿。马风桐[8]研究发现，CVA与Th1/Th2平衡失调也密切相关，Th1/Th2失调也可导致CVA发病。IFN-γ和IL-4不仅与气道炎症有关，而且作为维持Th1、Th2细胞的重要细胞因子，其含量变化在CVA病情变化中发挥着重要作用。CCL11是一类调节白细胞运输的可溶性蛋白介质，在炎症部位驱动白细胞聚集，若CCL11在局部增多，则会发生慢性炎症与病理组织损伤，同时在咳嗽变异性哮喘病理机制中发挥高度趋化作用[9]，所以本研究选择IFN-γ、IL-4和CCL11作为检测指标。

中医注重整体观念和辨证论治，且中药具有副作用小、多向靶点、价格低廉等优点，在治疗CVA中日益受到重视。中医将CVA归属于“咳嗽” “风咳” “哮咳”等范畴。罗世杰认为CVA主要病机为病久伤阴，发作时为外风引动伏痰，肺失宣降，肺气上逆为主，治疗应以“祛风宣肺，化痰滋阴止咳”为主，方选敏咳方[10]。本文围绕敏咳方对CVA治疗效果进行研究，同时，通过对IFN-γ、IL-4和CCL11的含量测定，探讨敏咳方治疗CVA的机制，以期为临床用敏咳方治疗CVA提供科学依据。

1  材料与方法

1.1 材料

在西咸新区沣东新城实验动物养殖场（动物许可证：SCXK（陕）2017-002）购入2周龄（约（180±20）g）雄性豚鼠50只。适应性喂养3 d后，将购回的豚鼠随机分为5组，放入不锈钢鼠笼，饲养于本校医学科研实验中心动物房。室内温度控制在20～26 ℃，湿度控制在40％～70％，室内光照周期采用12 h/12 h昼夜间断照明。动物饲料喂养。

1.2 药物

卵清蛋白冻干粉1 g（上海麦克林生化科技有限公司）、孟鲁司特纳咀嚼片（杭州默沙东制药有限公司）、辣椒素50 mg（上海皓元生物医药科技有限公司）、水合氯醛250 g（上海标模科技有限公司）、吐温-80（北京索莱宝科技有限公司）、豚鼠IL-4试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）、豚鼠IFN-γ试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）、豚鼠CCL11试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）、敏咳方免煎颗粒（四川新绿色药业科技发展有限公司，陕西中医药大学附属医院免煎颗粒药房提供）。

1.3 方法

1.3.1药物的制备

4％卵蛋白溶液（OVA）：在25 mL的生理盐水中放入1 g卵蛋白干粉配制成4％ OVA。

辣椒素溶液：将称取的30.5 mg辣椒素加入1 mL吐温-80溶液中，再加入1 mL无水乙醇溶液中溶解，最后加入生理盐水8 mL，配成10-2 mol/L辣椒素原液。

敏咳方剂量：药物浓度根据动物和人药物用量换算公式[10]。动物体表面积计算法Meeh-Rubner氏公式计算为：

A（体表面积，以m2计算）＝K×W2/3/1000（1）

式（1）中，W为体重（g）；K为常用系数。

动物种类不同体表面积也不同，豚鼠的K为9.8，人的K为10.6。首先计算8岁儿童的体表面积（体重按8岁儿童标准体重24 000 g）A为0.88 m2。敏咳方的儿童临床常用剂量为8 g/（kg·d）=218.18 m2/d。而豚鼠的体表面积（2周龄体重按200 g）A为0.034 m2，故等效剂量为37.09 g/（kg·d）（相当于8岁儿童临床等效剂量），高剂量为74.18 g/（kg·d）（相当于8岁儿童临床等效剂量2倍）。孟鲁司特钠给药剂量为0.1 mg/（100 g·d）（相當于8岁儿童临床等效剂量）。

1.3.２试验动物分组

将50只豚鼠适应性喂养3 d后，按随机原则和方法分为5组，每组10只，A组设为空白组、B组为孟鲁司特钠组、C组为敏咳方常量组、D组为敏咳方高剂量组、E组为模型组，见表1。

1.3.３造模方法

本次造模依据蔡黎等[10]在《山西医科大学学报》发表的改进后的CVA豚鼠模型构建方法建立：利用 OVA 和氢氧化铝致敏并用 OVA 激发的方法复制 CVA 模型豚鼠。在试验开始第 1 天，B、C、D、E 组每只豚鼠均肌肉注射 4％ OVA 溶液 0.5 mL，并同时腹腔注射 2％氢氧化铝 0.2 mL 第一次致敏；A 组以相同剂量的0.9%生理盐水代替 OVA溶液及氢氧化铝注射。试验第7天，重复上述给药过程进行第二次致敏，意在加强致敏，以防有部分豚鼠在第一次致敏后出现脱敏。试验第14天，将 B、C、D、E组的每只豚鼠均放在密闭玻璃箱内，然后打开雾化器，用1％ OVA 溶液雾化攻击，进行致敏后的激发（雾化率：0.5 mL/min），持续时间3 min，隔日1次，共7次（14 d），A组则以0.9%生理盐水代替 1% OVA 溶液，保证每次各组的激发时间及剂量一致。

模型评估：攻击激发咳嗽时观察各组豚鼠反应情况，若有咳嗽、竖毛、口鼻分泌物增多、烦躁、频繁抓脸、呼吸急促、喷嚏中两种或两种以上者，或出现腹肌收缩、抽搐等现象之一者，判定模型成功。

1.3.４标本采集与检测方法

各组豚鼠在末次喂养后禁食12 h，称量各组豚鼠体重并记录后，给予豚鼠腹腔注射10％水合氯醛（300 mg/kg）麻醉，然后将麻醉过的豚鼠固定在准备好的豚鼠固定板上，取仰卧位，心前区剪毛备皮，并用碘伏消毒皮肤，用注射器针头垂直刺入心跳搏动最强处，为避免溶血，快速吸出血液样本3 mL，转移至离心管中，做好标记，在室温下静置30 min待自然凝固，然后放入4 ℃低温高速离心机中以3 500 r/min，离心15 min，用清洁的微量移液器取上清液分装于 EP 管中，做好标记，置于-80℃冰箱中待测，采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组豚鼠IL-4、IFN-γ、CCL11的含量。首先用纯化的豚鼠IL-4、IFN-γ、CCL11包被微孔板，然后给微孔中依次加入标本、标准品HRP标记的检测抗体，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，再经过温育并彻底洗涤；加底物TMB 显色；用酶标仪在450 nm波长下测定OD值，并通过标准曲线，计算样品中豚鼠IL-4、IFN-γ、CCL11 的含量。

1.4 统计学方法

所有数据均采用SPSS22.0进行分析，统计方法为单因素方差分析和LSD检验法，均数±标准差为计量方法，检测结果P<0.05 ，表示差异有统计学意义，反之，则表示差异无统计学意义。

2  结果与分析

2.1 一般情况的观察

A组豚鼠的习性正常，眼睛明亮有神，对捕捉反应能力好，对光照、声响等外界环境变化十分敏感，奔跑迅速，被毛浓密且光亮，清洁贴身，食欲旺盛，有相当的饮食、水量，尿粪未见异常。

E组在以OVA雾化攻击前一般情况和A组基本相同，在OVA攻击的过程中，各豚鼠均表现出呼吸增快，出现抓耳挠鼻的洗脸样动作，对捕捉的反应能力下降，独隅一角。随着雾化激发次数的增加，各豚鼠甚至出现对捕捉不反抗，扎堆嗜睡，眼半闭，被毛粗乱，无光泽，沾染粪便，食欲明显减退，对饲料无反应，出现连声咳嗽，体重增长下降，甚至出现体重不增长，在试验结束时，有2只豚鼠死亡。

B、C、D组在OVA雾化攻击前一般情况基本同A组，在OVA雾化激发初期，出现呼吸频率加快、洗脸样动作、打喷嚏等，和E组的症状类似，给药物干预的过程中，上述症状有不同程度减轻，整体反应性明显改善，对捕捉反应灵敏，被毛由粗乱恢复贴身光亮，洗脸样动作明显减少，飲食水量恢复，体重增加，D组的一般情况改善明显好于其他药物干预组。试验结束时，E组有1只豚鼠死亡。

2.2 咳嗽次数测定

通过观察八通道研究型高速记录系统仪显示的张力变化波状图和人工计数咳嗽次数相结合，准确的测定豚鼠2 min内咳嗽次数。将各组豚鼠膈肌处和上腹部缠上带有挂绳的自粘弹性腹带，并用固定器控制豚鼠，然后放其在玻璃缸内，启动雾化器，雾化吸入10-4 mol/L辣椒素溶液60 s，关掉雾化机，让豚鼠在玻璃缸内停留1 min后打开玻璃盖，接通八通道研究型高速记录系统仪，观察揭盖后2 min内八通道研究型高速记录系统仪图形的波动次数，并通过读波动图，数出每只豚鼠的咳嗽次数（如图1），同时一人进行人工计数豚鼠此时间范围内的咳嗽次数，并做记录，准确的测定豚鼠2 min内咳嗽次数。结果见表2。

由图1所示，当豚鼠咳嗽时会出现腹部抽动，腹肌压力增大，刺激八通道研究型高速记录系统仪显示波动的图像从而记录当时的张力，通过观察波形图确定豚鼠的咳嗽次数。

如表2所示，E组豚鼠咳嗽次数明显高于A组（P＜0.05），差异有统计学意义，说明采用改进后的CVA豚鼠模型构建方法造模成功；B、C、D组咳嗽次数较E组明显减少（P＜0.05），说明孟鲁司特钠和敏咳方对CVA的治疗有效；B组和C组咳嗽次数无明显差别（P＞0.05），无统计学差异，说明孟鲁司特纳与敏咳方常剂量对CVA治疗效果相同；D组咳嗽次数较C组明显减少（P＜0.05），说明不同剂量敏咳方对咳嗽变异性哮喘疗效不同，敏咳方高剂量对咳嗽变异性哮喘止咳效果最显著。

2.3 豚鼠血清中IL-4、IFN-γ、CCL11的含量的检测

采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组豚鼠的IL-4、IFN-γ、CCL11的含量，检测结果见表3。

如表3所示，E组豚鼠血清中IL-4和CCL11的含量明显高于A组，IFN-γ含量明显低于A组（P＜0.05），有统计学差异，说明CVA复制模型成功。B、C、D组IL-4和CCL11的含量低于E组，IFN-γ含量高于E组（P＜0.05），说明孟鲁司特钠和敏咳方可以降低CVA豚鼠血清中IL-4和CCL11的含量，升高IFN-γ含量，减少炎症因子的产生，降低气道高反应，提高人体免疫力，从而达到治疗CVA的效果。B组和C组的IL-4、CCL11和IFN-γ的含量无明显差异（P＞0.05），说明孟鲁司特纳对降低CVA豚鼠血清中IL-4和CCL11的含量、升高IFN-γ含量和敏咳方常剂量相同，在治疗CVA时，敏咳方常剂量和孟鲁司特纳对CVA患者疗效相同。C组的IL-4和CCL11的含量高于D组，IFN-γ含量低于D组（P＜0.05），说明敏咳方高剂量对CVA豚鼠血清中IL-4和CCL11降低和IFN-γ升高较敏咳方常量显著，敏咳方高剂量对CVA患者疗效优于敏咳方常剂量。

3  讨论与结论

CVA是儿童临床常见病和多发病，西医对其病因和发病机制仍在不断探索中，治疗上并无特效药物可以根治此病，对CVA的治疗主要参考哮喘治疗方案，常选用β受体激动剂、糖皮质激素、白三烯受体拮抗剂、抗胆碱能药物为主，虽能缓解临床症状，但长期服用副作用大，且停药后复发率高[11]。中医注重整体观念和辨证论治，且中药具有副作用小、多向靶点、价格低廉等优点，在治疗CVA中日益受到重视。陕西省名中医罗世杰教授具有多年的临床经验，对儿童CVA病因病机有独特的认识[12]，在CVA治疗上颇有经验。罗教授课题组成员运用敏咳方治疗CVA，认为CVA的病因与风邪、伏痰密切相关。感受风邪是引起CVA的外在因素，伏痰是引起CVA的重要内在因素。CVA主要病机为病久伤阴，发作时为外风引动伏痰，肺失宣降，肺气上逆为主。肺为华盖，风邪入侵，首当犯肺。小儿肺脏娇嫩，易受外邪侵袭，使肺主宣发肃降功能失调，肺气上逆，引发咳嗽。小儿脾常不足，脾虚运化水谷精微失司，水谷精微聚集成痰，上犯入肺，外邪引动，则发为咳嗽。脾为肺之母，后天之本，脾虚肺失濡养，亦影响肺宣降之功能，引发咳嗽。正如徐春甫所言“痰气互结、气道受阻，肺气逆而作咳”[13]。咳嗽时日过长，则邪气郁久化热，热盛耗气伤阴，而成阴虚咳嗽。故认为CVA的主要病机为病久伤阴，发作时为外风引动伏痰，肺失宣降，肺气上逆。治疗应以“祛风宣肺，化痰滋阴止咳”为主，自拟敏咳方。

敏咳方是由过敏煎和止嗽散加减而成，具体方药为桔梗5 g、前胡8 g、杏仁8 g、炙百部9 g、五味子6 g、银柴胡8 g、紫菀6 g、款冬花6 g、桃仁8 g、葶苈子10 g、连翘10 g、乌梅12 g、防风8 g、甘草6 g。方中紫菀、百部长于止咳化痰，对新久咳嗽皆有效。桔梗善开宣肺气，前胡善降气化痰，两者配伍，一宣一降，恢复肺之宣降。杏仁、桃仁两药可润肠通便，平喘止咳，通过泄浊气达到宣肺气，并且桃仁具有活血之功，还体现出治风先治血，血行风自灭之用药特点。葶苈子、款冬花降气化痰平喘，诸药合用，增强止咳之效，同时还具有化痰平喘之功。防风辛温发散，可祛除一切风邪，乌梅酸涩收敛，一收一散，使散不伤正，收不留邪；连翘、银柴胡清宣肺热，二药合用不仅可祛除邪气，还可以滋阴敛肺，防止病情发展。甘草调和诸药。诸药相配，有收有散，升降并举，使祛邪不伤阴，滋阴不留寇，从而达到祛风宣肺，化痰滋阴止咳之效。现代药理学研究显示，敏咳方中防风能阻断炎症介质的传递途径，降低血清中炎性因子产生[14]；乌梅可能是通过阻断PI3K/Akt和MAPK细胞信号传导通路，抑制肥大细胞脱颗粒，防风-乌梅药对可抑制气管平滑肌细胞（ASMCs）由收缩型向合成型的转化，减轻支气管平滑肌肥厚，减少一些炎症介质释放，降低气道炎症，改善CVA小鼠气道重塑[15]；五味子能减少过敏皮肤组织的组胶、IgE受体基因表达，抑制肥大细胞释放炎症因子，具有抗炎作用[16]。银柴胡可以抑制炎症细胞产生释放炎症因子IL-4[17]。本研究显示，敏咳方可降低CVA豚鼠血清中IL-4和CCL11的含量，升高IFN-γ含量，调节CVA模型豚鼠的免疫失衡状态，干预TH1/TH2平衡，抑制气道炎症，降低气道高反应，明显改善CVA豚鼠的一般情况，减少CVA豚鼠的咳嗽次数，从而达到治疗CVA的效果。

目前关于中药治疗儿童 CVA 的实验室药理机制研究仍较其他疾病少，今后应通过更多新的研究方法对中医效验方进行现代药理药效学研究，为中医辨治儿童 CVA 提供更多实验室证据。关于敏咳方治疗CVA的作用机制，可从分子表达和信号通路方面深入研究；关于 CVA 的预防和长期管理，除临床医生应帮助 CVA 患儿早期识别和避免转变为CA的危险因素外，或可基于“互联网+”儿童医疗健康服务系统探索个性化、动态、全程的线上线下相结合的健康管理模式。

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