基于网络药理学探索延胡索抗心绞痛机制

侯凯　何淼　郭新星　秦旭平

摘 要：目的 利用網络药理学方法探索延胡索（Corydalis Rhizoma）治疗心绞痛的主要有效成分和作用靶点，为阐明延胡索药理作用机制提供参考。方法 利用TCMSP、GeneCards数据库，参考有关文献收集延胡索防治心绞痛的活性成分和交叉靶点；再利用Cytoscape 3.9.1软件，建立延胡索有效成分和心绞痛共同作用靶点的网络图；STRING数据库进行PPI网络的生成与分析。采用DAVID数据库进行GO分析、KEGG通路富集分析；结合AutoDockTools软件和PyMOL软件进行分子对接验证其作用靶点。结果 共获得16个延胡索有效成分和141个靶点与治疗心绞痛相关，这些靶点包括细胞外间隙组分、酶体系、HIF-1、肿瘤坏死因子等信号通路等。分子对接表明，所筛选出的延胡索主要有效成分与核心作用靶点均有良好的亲和力，结合能较低。结论 延胡索多种成分与机体内多个信号通路、多个靶点相互作用是其治疗心绞痛的重要作用机制。

关键词：延胡索；心绞痛；网络药理学；分子对接

中图分类号：R96

文献标志码：A

Exploring on the mechanism of Corydalis Rhizoma against angina pectoris based on network pharmacology

HOU Kai HE Miao GUO Xinxing QIN Xuping

（1. The Centre of Clinical Research of Second Affiliated Hospital， University of South China， Hengyang 421001， China; 2. The Department of Neonatogy， Jincheng Hospital， Jincheng 048000， China; 3. Institute of Pharmacy & Pharmacology， School of Pharmacy， University of South China， Hengyang 421001， China）

Abstract： Objective To explore the main effective components and action targets of Corydalis Rhizoma in the treatment of angina pectoris by network pharmacology， and to provide reference for elucidating pharmacological mechanism of Corydalis Rhizoma. Methods The active components and cross targets of Corydalis Rhizoma for the prevention and treatment of angina pectoris were collected by using TCMSP and GeneCards databases and referring relevant literature. Then， the network diagrams of active components， angina pectoris and common targets of Corydalis Rhizoma were established by used Cytoscape 3.9.1 software. The PPI network was generated and analyzed through STRING database. GO analysis and KEGG pathway enrichment analysis were processed by DAVID database. The molecular docking verification was carried out by combining AutoDockTools software and PyMOL software. Results A total of 16 active components of Corydalis Rhizoma for and 141 targets the treatment of angina pectoris were obtained in the study. These targets including cellular components，enzyme binding， HIF-1 signal pathway， TNF signal pathway， etc. Molecular docking experiments showed that the main effective components of Corydalis Rhizoma had good affinity and low binding energy with the core target. Conclusion The interaction of various components of Corydalis Rhizoma with multiple signal pathways and targets in the body is an important mechanism of its treatment of angina pectoris.

Key words： Corydalis Rhizoma; angina pectoris； network pharmacology； molecular docking technology

心绞痛（angina/angina pectoris）是由于冠状动脉供血不足导致心肌暂时性缺血缺氧所引起的临床综合征，以胸骨部短暂性疼痛和胸部不适为主要症狀[1]。心绞痛的发生率一般与年龄呈正相关，最近有研究显示，因作息方式不佳和工作压力的不断增大，导致心血管方面的疾病发生率不断攀升[2]。目前，临床上治疗心绞痛首选药物治疗，如舌下含服硝酸甘油，服用硝苯地平等，如果药物治疗不能达到预期的效果，可以选择经皮冠状动脉介入治疗或者冠状动脉旁路移植[3]。植物延胡索（Corydalis Rhizoma）是一种常见的中草药。延胡索属于罂粟科紫堇属，被用于入药治病已有近千年的历史，有止痛、活血、利气的作用[4]。长期以来，对于中药治疗疾病的机制是按照独特朴素中医理论来解释，缺乏可视化现代化医学理论支撑。迄今从延胡索中分离出的化学成分已达110余种[5]。现代医学研究表明，延胡索具有抑制疼痛、稳定情绪、安神、扩张冠状动脉、保护心肌缺血等多种药理作用[6]，但其分子药理作用机制尚不完全清楚。网络药理学融合系统生物学、生物信息学、网络科学等学科，从系统层次和生物网络的整体角度出发，解析药物与治疗对象之间的分子关联，对揭示中药物的多成分、多靶点的系统性或整体性治疗作用机制[7]以及正确使用药物、发明新药物等有重要意义[8]。本研究通过网络药理学及分子对接技术，探索延胡索治疗心绞痛的有效成分和作用靶点，为其临床应用及其潜在的作用机理提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 延胡索有效成分的筛选及对应靶点的获取

通过TCMSP数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），获得延胡索的所有活性化合物，并设定其过滤条件，即口服生物利用度（oral bioavailability，OB）大于等于30%，类药性（drug-like properties，DL）≥0.18，并根据延胡索治疗心绞痛的相关文献，筛选出其全部有效成分信息及对应有效成分的靶点。利用UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/），将延胡索有效成分的靶点进行规范化，然后将有效成分的靶点名称转换为基因名，将UniProt数据库中无法找到的靶点进行剔除，最后对转换后的靶点进行去重。

1.2 心绞痛疾病靶点的获取

借助GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/），找到与心绞痛疾病相关的靶点，在搜索栏中输入检索词“angina”，导出检索出的疾病靶点信息。

1.3 延胡索与心绞痛共有靶点的获取

利用Venny 2.1.0平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），找到延胡索有效成分靶点和心绞痛疾病靶点之间的相同靶点，即交集靶点。将药物靶点和疾病靶点分别复制粘贴到两个列表中，点击相交的区域部分，得到交集靶点，绘制并保存Venny图。

1.4 药物成分-疾病-靶点网络图的建立

结合延胡索有效成分与心绞痛的交集靶点，建立延胡索有效成分、心绞痛疾病及交集靶点数据的network文件和type文件，并在Cytoscape 3.9.1软件中点击“File”，再按“Import”，分别将上述2个文件导入该软件中，构建出延胡索有效成分、心绞痛疾病及交集靶点的网络图，并对延胡索有效成分、心绞痛和靶点之间的相互作用关系进行网络可视化。

1.5 蛋白质互作（protein protein interaction， PPI）网络的构建

将延胡索与心绞痛的交集靶点复制粘贴到STRING数据库（https：//cn.string-db.org/cgi/input.pl）的列表中，选择“多种蛋白质”，选定物种为“人”，下载并保存TSV文件，通过Cytoscape 3.9.1软件对该文件进行网络分析和处理，构建PPI网络图，并使用“Network Analyzer”插件进行网络拓扑参数分析，以度（degree）中心性（degree centrality，DC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、中介中心性（betweenness centrality，BC）3项指标都大于平均数作为筛选指标，在筛选出的靶点中选择前3个靶点作为关键靶点。在此基础上，利用Cytoscape 3.9.1软件中的插件MCODE对PPI网络中的子模块进行筛选，筛选条件为Max.Depth=100，Degree Cutoff=2，K-Core=2，Node Score Cutoff=0.2。

1.6 基因本体（gene ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

利用DAVID（https：//david-d.ncifcrf.gov/）数据库，对交集靶点进行GO分析和KEGG通路富集分析，GO分析包含生物过程（biological proless，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cellular component，CC），根据P值（P＜0.05）和错误发现率（false discovery rate，FDR）<0.05对BP、MF、CC和信号通路进行筛选和分析。

1.7 分子对接

从TCMSP数据库中下载延胡索有效成分的2D结构信息，并将其作为MOL2文件形式保存，然后在PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）的检索栏中输入核心靶点，以物种为“Homo sapiens”，分辨率较低，方法为X-RAY衍射为筛选准则，同时结合与心绞痛相关的分子对接文献，筛选并下载核心靶点的3D晶体结构信息，以PDB格式保存，然后将其导入PyMOL软件，通过PyMOL软件对靶蛋白质受质体进行移除水分子和删除配体等操作，最后采用AutoDockTools软件来完成分子对接，在软件中计算出延胡索有效成分与关键核心靶点之间的结合能，利用PyMOL软件进行结果的可视化分析和处理。

2 结果

2.1 延胡索有效成分的筛选及对应靶点

将检索词“延胡索”输入在TCMSP数据库中，共获得77种化学成分，通过OB≥30%、DL≥0.18的条件筛选，在TCMSP数据库中查找延胡索化学成分所涉及到的相关疾病，最终筛选得到15个与心绞痛相关的延胡索有效成分。另外，根据文献中关于心绞痛和延胡索方面的研究，增加了1个与心绞痛有关的延胡索有效成分，最后获得16种延胡索有效成分，包括槲皮素、延胡索乙素、紫堇碱等，如表1所示。 然后在TCMSP数据库中获取以上16个有效成分的对应靶点，共得到443个靶点，通过UniProt数据库将靶点的蛋白质名称进行转换，将数据库中匹配不到的靶点进行删除后，得到349个靶点，最后删除以上靶点中相同的靶点，最终得到延胡索有效成分的靶点161个。

2.2 心绞痛疾病靶点

通过GeneCards数据库，得到与心绞痛疾病相关的靶点4 241个。

2.3 延胡索与心绞痛共有靶点

将延胡索有效成分的161个靶点和心绞痛疾病的4 241个靶点输入到Venny 2.1.0平台中，对以上靶点进行取交集操作，最终获得相同的靶点141个，见图1。图中延胡索有效成分靶点和心绞痛疾病靶点相交的部分即为交集靶点。

2.4 药物成分-疾病-靶点网络图的构建

利用Cytoscape 3.9.1软件，对16个延胡索有效成分和141个交集靶点建立延胡索有效成分、心绞痛疾病和靶点网络图（图2）。该图包括159个节点（1个药物，1个疾病，16个有效成分，141个交集靶点）和462个边，其中交集靶点为菱形，延胡索有效成分为圆形，疾病为三角形，药物为箭头。在网络图中，Degree值越高，节点就越大，根据Degree值筛选出排名前5的延胡索有效成分，从图2中可以看出，排名前5位的延胡索主要有效成分分别是槲皮素（quercetin）、延胡索乙素（tetrahydropalmatine）、紫堇碱（capaurine）、异托林（isotoline）、诺格拉辛（norglaucing），说明以上5种成分在治疗心绞痛的过程中发挥重要作用。

2.5 PPI网络的构建

将141个交集靶点输入到STRING数据库中，进行PPI网络分析，去除网络中游离的节点，设置最大置信度为0.900，用TSV格式文件输出分析结果，利用Cytoscape 3.9.1软件对TSV文件进行了网络可视化分析。结果如图3所示，该网络由118个节点和446条边组成，每一个节点都是一个交集靶点，每一条边表示靶点之间的相互作用关系。节点的圆圈大小和颜色的深浅，与靶点的Degree值呈正比；边线条越粗，颜色越深，则表示靶点之间的相互作用关系越强烈。接着，利用“Network Analyzer”插件对该网络进行了拓扑参数分析，并对其进行数据处理，计算得出该网络中节点的DC平均数为7.559，BC平均数为0.018，CC平均数为0.349。在网络中，DC、BC、CC均大于平均数的排名前3位靶点依次是JUN、MAPK1、AKT1（表2）。另外，利用Cytoscape 3.9.1软件中的插件MCODE对PPI网络进行分析，得出了起核心作用的2个主要的子模块（图4，表3）。

2.6 GO分析和KEGG通路富集分析

2.6.1 GO分析

用DAVID数据库对141个交集靶点进行GO分析，根据P<0.05，FDR<0.05进行筛选，结果显示，得到的生物过程有238个，细胞组分有29个，分子功能有48个。选取3个类别中P值最低的评分前10条（图5）。从图中可以看出，延胡索对心绞痛的作用主要涉及对药物的反应、正调控RNA聚合酶II启动子的转录、DNA模板等生物过程；包含细胞质、细胞外间隙、膜筏等细胞组分；参与RNA聚合酶II转录因子活性、酶结合、蛋白质结合等分子功能。这些结果提示，延胡索可能通过多种作用途径治疗心绞痛，对心绞痛的治疗有一定的影响。

2.6.2 KEGG通路富集分析

采用DAVID数据库，对141个交集靶点进行KEGG通路富集分析，根据P<0.05，FDR<0.05进行筛选，结果显示共有111条通路，对信号通路按顺序排列，选择P值最低的排名前20条信号通路制作条形图（图6）。从图中可以看出，延胡索对心绞痛的治疗主要包括VEGF信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-AKT信号通路、肿瘤坏死因子信号通路，且与非小细胞肺癌、膀胱癌、乙型肝炎相关的信号通路有关。这表明延胡索治疗心绞痛是通过多条信号通路发挥药理作用的。

2.7 分子对接结果

分子间的对接使用AutoDockTools軟件来进行操作。在PDB数据库中筛选出关键核心靶点，JUN受体蛋白的PDB编号为5D7F，MAPK1受体蛋白的PDB编号为4ZZN，AKT1受体蛋白的PDB id为6NPZ。通过对3个核心靶点和延胡索的5个有效成分进行分子对接，计算出了有效成分与受体蛋白JUN、MAPK1、AKT1之间的最低结合能，对接结果见表4。如果结合能小于零，则表示有效成分能与受体蛋白自发地结合，而且它们之间的结合能愈小，表示其对接结果愈佳，受体与配体间的亲和力越大，结合构象越稳定。从表格中可以看出，槲皮素、延胡索乙素、紫堇碱、异托林、诺格拉辛与JUN、MAPK1、AKT1的结合能均为负值，所以，延胡索的5个有效成分与3个关键核心靶点的结合能都比较好，均有较优良的结合活性，其中，JUN与槲皮素、延胡索乙素、紫堇碱和诺格拉辛的结合构象更稳定，对它们进行可视化处理，见图7。

3 讨论

心绞痛是一种急性心脏疾病，中医治疗常采用“活血化瘀”法、“芳香温通”法和“祛痰通络”法[9]。延胡索具有治疗血中气滞、气中血滞、气血不畅等功效，对身体各个部位的气滞血瘀均有较好的治疗效果，其中，延胡索的止痛作用更是被历代医学家称赞。WANG等[10]的研究表明，延胡索的提取物具有良好的抑制疼痛作用，特别是治疗急性伤害性疼痛、急性炎症和神经性疼痛。迄今为止，从延胡索中提取到的化合物已达100余种，延胡索的主要活性成分为生物碱，包括叔胺碱和季胺碱[11]，本研究利用TCMSP数据库对其进行分析，共筛选获得了77种延胡索的化学成分。通过TCMSP数据库筛选和文献查阅，最后获得16种延胡索有效成分与心绞痛相关，包括槲皮素（quercetin）、延胡索乙素（tetrahydropalmatine）、紫堇碱（capaurine）、异托林（isotoline）、诺格拉辛（norglaucing）等。16种延胡索有效成分与心绞痛相关靶点有141个。并利用Cytoscape 3.9.1软件，使成分与疾病交集靶点进一步可视化。这些结果进一步解释了他人的研究成果，比如对槲皮素对心血管作用[12-16]，延胡索乙素的抗心律失常、保护心肌等心血管功能[17-19]。另外，本文还预测了紫堇碱、异托林、诺格拉辛等对心绞痛也可能具有良好的疗效，这有待于今后研究证实。

通过对交集靶点进行PPI网络的构建与分析，并根据相关文献报道，归纳出了延胡索在抗心绞痛方面作用最显著的几个核心靶点，包括JUN、MAPK1、AKT1等。并通过相关指标显示出靶点之间相互作用关系的强弱。其他学者研究发现，原癌基因编码的蛋白质JUN和FOS是激活蛋白-1（AP-1）的主要组成部分，AP-1在细胞的增殖、存活、凋亡、分化以及炎症等多种细胞过程中有关键影响[20]。AP-1可以调节血管粥样硬化的形成并减轻病变的进展过程，还能使血管粥样硬化的斑块保持稳定。MAPKs是一类丝裂原活化蛋白激酶，是一种能够将细胞表面的信号转导到细胞核里面的关键因子。目前，在哺乳动物中，已经发现了12种MAPK，MAPK通路是促进细胞生长、产生应激反应、炎症反应、细胞转化和凋亡等信号通路的共同作用的通路之一。MAPK通路参与了JUN和FOS的基因转录和激活AP-1[21]。AKT1是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于蛋白激酶B家族。它是PI3K/AKT信号通路的关键因子，参与细胞的增殖、生长和凋亡的重要分子[22]，该通路也参与了冠心病的病理形成过程[23]。REINARTZ 等[24]研究发现，AKT在部分磷酸酯蛋白的作用下会与激发-收缩偶联连接，从而影响心肌细胞的新陈代谢、生长和存活。AKT1基因的缺失则会导致血管内皮细胞（endothelial cells，ECs）的功能紊乱，从而引起血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）在血管中的迁移和存活的变化，同时也对冠状动脉阻塞和动脉粥样硬化有促进作用，还会导致斑块的脱落，对心血管疾病产生不可逆转的影响[25]。除此之外，通过对PPI网络进行聚类分析，得到了2个得分较高的子模块，其中，得分最高即作用最显著的子模块1包含MMP3、VEGFA、IL6、CXCL10等，而这些基因与炎症，细胞凋亡有关，从而进一步表明，延胡索抗心绞痛的作用机制可能是通过调控细胞的凋亡与炎症反应来达到治疗效果的，这些结果符合本研究预测结果。

通过KEGG通路富集分析发现，延胡索对心绞痛的治疗作用涉及VEGF信号通路、TNF信号通路、PI3K-AKT信号通路、HIF-1信号通路等。PI3K-AKT信号通路[26]可以通过直接减少下游调节细胞凋亡和存活的靶点，从而保护心肌细胞，抑制凋亡，并通过磷酸化FoxO蛋白亚型，使其转录活性降低，间接阻止细胞的凋亡[27]。VEGF是血管内皮生长因子，参与血管内皮细胞的增殖、迁移以及血管的形成，它可以通过调节VEGF信号通路来防止斑块形成，从而维持斑块的稳定[28]，WANG等[29]通过研究发现，哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的过表达，可以诱导AP-1升高VEGF，进而促进内皮细胞的增殖，促进血管的生成。肿瘤坏死因子（TNF-α）是一种具有多种作用效果的细胞因子，它可以通过多条信号通路来调节炎症反应和细胞凋亡。TNF信号通路被激活后，可导致血管平滑肌细胞受损，从而对斑块的稳定性造成损害，TNF信号通路还参与动脉粥样硬化的产生和发展[30]。YANG等[31]的研究表明，TNF-α可以激活肿瘤坏死因子受体1（TNFR1），进而激活PI3K/AKT的活性，提高AP-1启动子的活性。HIF-1信号通路也参与了心血管疾病的产生和进展，HIF-1是一个异二聚体，由α和β两个亚基构成，其中HIF-1α亚基起重要作用。HIF-1α在细胞轻度缺氧状态下，通过对细胞凋亡的抑制来保护心肌细胞；HIF-1α在细胞严重且长时间缺氧的情况下，可通过诱导细胞凋亡的方式来降低其对周围心肌细胞带来的损伤[32]。以上结果表明，延胡索对心绞痛的治疗作用与多种信号途径有关，如炎症反应、免疫反应、氧化应激反应、细胞凋亡代谢等。

本研究对3个关键核心靶点与5个延胡索有效成分进行了分子对接验证，结果表明，在有效成分与关键核心靶点的对接中，JUN与紫堇碱、诺格拉辛、槲皮素、延胡索乙素均存在较强的结合作用，它们之间的结合能均小于0，這说明它们之间的分子对接结合构象相比其他成分与靶蛋白的分子对接构象更稳定。由此可知，尽管目前缺乏相关文献报道，但进一步研究紫堇碱、诺格拉辛对心绞痛治疗效果实属必要。

综上所述，本研究采用网络药理学方法，证明延胡索是通过多种有效成分、多个作用靶点、多条信号通路的方式来治疗心绞痛，涉及到炎症反应、细胞凋亡代谢等一系列生物过程。延胡索的5个潜在有效成分（槲皮素、延胡索乙素、紫堇碱、异托林、诺格拉辛）与心绞痛的3个重要靶点（JUN、MAPK1、AKT1）相互作用是延胡索抗心绞痛的主要作用机制，以上分析结果可为解释延胡索抗心绞痛药理作用提供了现代医学理论依据。

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