孤雌胚胎干细胞在细胞移植和治疗上的应用

征月良

摘 要：研究发现，卵子孤雌激活后，从囊胚中获得孤雌胚胎干细胞（parthenogenetic embryonic stem cells，pESCs），pESCs表达多能性标志物，发生表观遗传修饰重编程。它们具有高度的分化潜能，在体内可产生畸胎瘤，在体外能形成类胚体。pESCs能分化成多种类型的细胞，已被用于细胞移植治疗研究。用pESCs分化来的成纤维细胞构建皮肤组织，移植到皮肤缺损处，能促进伤口愈合。源自pESCs的成骨细胞、成软骨细胞和肌腱细胞接种到支架上并移植到皮下后，能再生出骨、软骨和肌腱组织，从而可以为治疗这些组织的损伤提供细胞来源。pESCs分化产生的心肌细胞移植到患急性心肌梗死的宿主心脏后，可改善心脏功能。由pESCs分化的神经干细胞或神经元移植到受损大脑或患帕金森病的宿主大脑后，也能促进大脑皮层的修复，改善宿主的运动缺陷。因此，pESCs在临床上具有重要的应用和推广价值，从而为疾病的细胞移植治疗提供理论依据和临床应用策略。

关键词：孤雌胚胎干细胞；分化；细胞移植；细胞治疗；疾病

中图分类号：Q813

文献标志码：A

Applications of parthenogenetic embryonic stem cells in cell transplantation and cell therapy

ZHENG Yueliang

（College of Life Science， Linyi University， Linyi 276000， China）

Abstract： Parthenogenetic embryonic stem cells （pESCs） can be established from blastocysts after parthenogenetic activation of oocytes. pESCs express pluripotent markers and undergo epigenetic modification reprogramming. They have high differentiation potential， and can produce teratomas in vivo and embryoid bodies in vitro. Studies have shown that pESCs can differentiate into many types of cells and have been used in cell transplantation and cell therapy research. The fibroblasts differentiated from pESCs can be used to construct skin tissue， which can promote wound healing after being transplanted to the skin defects. Osteoblasts， chondroblasts， and tenocytes derived from pESCs can regenerate bone， cartilage， and tendon tissue after being seeded into the scaffolds and used for subcutaneous transplantation， thus providing cellular sources for the treatments of injuries of these tissues. Cardiomyocytes differentiated from pESCs can improve the cardiac function after they are transplanted into the hearts of hosts with acute myocardial infarction. Transplantation of neural stem cells or neurons derived from pESCs into the injured brains or the brains of hosts with Parkinsons disease can also promote the repair of cerebral cortex and ameliorate motor deficits of hosts. Therefore， pESCs have important clinical applications and promotion values， thus providing theoretical basis and clinical application strategy for cell transplantation and treatment of diseases.

Key words： parthenogenetic embryonic stem cells； differentiation； cell transplantation； cell therapy； disease

在正常有性生殖過程中，精子基因组和卵子基因组结合，获得受精胚胎，胚胎在双亲遗传物质的控制下进行发育。待胚胎发育至囊胚阶段，从受精囊胚可获得胚胎干细胞（embryonic stem cells derived from fertilized blastocysts，fESCs）[1]。哺乳动物的卵子孤雌激活后，也可产生胚胎，这种孤雌胚胎的发育仅是在卵子遗传物质的控制下进行的。孤雌胚胎也能发育至囊胚，从囊胚可获得孤雌胚胎干细胞（parthenogenetic embryonic stem cells， pESCs）。近年来，pESCs已成为干细胞研究的热点之一，人们对这种干细胞的特性及其在细胞移植治疗上的应用有了一定的了解。

卵子孤雌激活后，获得pESCs。小鼠pESCs在体外培养时，形成碟状集落，具有碱性磷酸酶活性，表达多能性标志八聚体结合转录因子3/4（octamer-binding transcription factor 3/4，OCT3/4）、阶段特异性胚胎抗原1（stage-specific embryonic antigen-1，SSEA-1）和NANOG，这些产物对维持pESCs的未分化状态起重要作用[2]。pESCs的印迹基因发生表观遗传修饰重编程，这种重编程与甲基化水平变化有关。人pESCs在传代过程中，H19和Meg3的差异甲基化区域（differentially methylated regions，DMR）未发生甲基化，而Snrpn的DMR发生甲基化，引起H19和Meg3的表达上调及Snrpn的表达下调[3]。MAI等[4]对人pESCs中父系印迹基因的表达进行研究，发现有些印迹基因的表达水平与fESCs相同，而其他印迹基因在pESCs中表达水平下降。相比于fESCs，人pESCs中母系印迹基因的表达上调[5]。

pESCs具有高度分化潜能，将其注射到裸鼠体内，能形成畸胎瘤。畸胎瘤含有来自外胚層的神经节、中胚层的软骨和内胚层的腺体。将pESCs进行体外悬浮培养，能分化成类胚体（embryoid bodies，EBs）。小鼠EBs用视黄酸处理后，置于成脂诱导培养基中，可产生脂肪细胞[6]。人pESCs可分化为肝细胞，此分化细胞具有常规肝细胞的典型超微结构，表达肝细胞标志蛋白CK18和Hepa。吲哚菁绿染色表明这种肝细胞是功能性细胞，对物质具有吸收和代谢能力[7]。pESCs不仅可分化为体细胞，也可分化为生殖细胞。将小鼠pESCs先分化为原始生殖细胞样细胞（primordial germ cell-like cells，PGCLC），然后将PGCLC移植到肾包膜中，可获得卵子，卵子成熟和受精后，能成功产生小鼠幼崽[8]。

pESCs表达自然杀伤细胞（natural killer， NK）活化性受体的配体，对NK细胞的杀伤非常敏感。在pESCs分化后，这种配体的表达下调，从而分化细胞获得对NK细胞杀伤的抵抗力。来自pESCs的分化细胞移植后，如果移植物中仍含有pESCs，可能会增加移植的安全性，因为NK细胞会将pESCs作为靶细胞而减轻对分化细胞的杀伤[9]。尽管pESCs在体内可能形成畸胎瘤，但与fESCs相比，pESCs形成畸胎瘤的风险较低[10]。近年来，pESCs已用作一种重要的干细胞来源，以分化产生成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、心肌细胞、神经干细胞和神经元，来进行细胞移植治疗研究。

1 分化成纤维细胞

胚胎干细胞在构建组织工程化皮肤方面具有巨大的应用前景。皮肤成纤维细胞的增殖和生长对于皮肤再生是重要的。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是细胞治疗的重要细胞来源，它产生的外体能提高胞外信号调节激酶1/2的磷酸化水平，促进皮肤成纤维细胞的增殖[11]。MSCs的条件培养基中含有许多与皮肤再生相关的生长因子，能刺激皮肤成纤维细胞的生长和细胞外基质的产生，有利于皮肤伤口的愈合[12]。将小鼠pESCs进行悬浮培养，形成EBs，然后将EBs进行贴壁培养，从EBs的生长物中富集MSCs。用结缔组织生长因子对MSCs进行处理，MSCs能定向分化为成纤维细胞，这种分化细胞与fESCs分化来的成纤维细胞类似，均能表达高水平的FGF、EGF、VEGF等生长因子，这些生长因子对伤口愈合和皮肤修复是重要的。将pESCs分化来的成纤维细胞接种到胶原凝胶，形成组织工程化皮肤等效物（tissue-engineered skin equivalents，TESE），能嵌入胶原凝胶中且活力高。TESE移植到小鼠的皮肤缺损处后，能促进伤口愈合，未出现明显炎症反应。皮肤缺损处发生上皮再生过程，在TESE移植后15 d被成功修复[13]。

2 分化成骨细胞和软骨细胞

骨的形成可通过软骨内途径和骨膜内途径实现，前一种途径是骨骼干细胞（skeletal stem cell，SSC）在初始软骨模板上形成骨，后一种途径是骨膜干细胞（periosteal stem cell，PSC）在骨膜内分化成骨[14]。SSC也可分化形成软骨，BMP2和sVEGFR1的共同作用有利于SSC向软骨分化[15]。pESCs具有分化成骨和软骨组织的潜能。先将小鼠pESCs进行悬浮培养，形成球状EBs，然后将EBs置于涂有明胶层的培养皿中，进行贴壁培养，获得纺锤状MSCs。将MSCs分别在成骨分化培养基和成软骨培养基中培养，分化为成骨细胞和成软骨细胞。源自pESCs的成骨细胞（pESC-derived osteoblasts，pDOs）表达骨桥蛋白和骨钙素，而来自pESCs的成软骨细胞（pESC-derived chondroblasts，pDCs）表达II型胶原α1链和软骨蛋白聚糖。将pDOs和pDCs分别接种到珊瑚支架和褐藻酸钠支架上，它们均能在支架上存活，pDOs附着于珊瑚表面并生长到珊瑚孔中，pDCs在褐藻酸钠凝胶中生长，形成圆形集落。把这些支架移植到裸鼠背部皮下后，没有炎症发生，pDOs和pDCs在移植处成功再生出骨和软骨组织。pDOs形成的骨组织为红色，外被结缔组织包裹，表面有骨小梁，内部是软骨，表明这种骨是通过软骨内骨化的方式形成的。纤维组织分布于骨和软骨之间，小血管穿过骨组织，血管内有红细胞。尽管珊瑚支架存在于这种骨组织中，但可以通过脱矿质作用去除。pDCs形成半透明软骨，有柔韧性和抗压性，外被结缔组织包被，椭圆形细胞散在分布于软骨基质中。软骨具腔隙，有少量血管穿过。pESCs能够分化成骨和软骨组织，为治疗这些组织的损伤提供了一种细胞来源[2]。

3 分化成肌腱细胞

肌腱可以将力从肌肉传递到骨骼，以支持身体运动，肌腱细胞是肌腱再生的一种理想细胞来源。肌腱干细胞表达促微管聚合蛋白3和血小板衍生生长因子受体α，它可分化为肌腱细胞，在肌腱再生中起重要作用[16]。诱导多能性干细胞也可分化为肌腱细胞，这些细胞移植到受损肌腱后，能促进肌腱再生[17]。将小鼠pESCs分化成MSCs后，再通过循环机械拉伸对MSCs进行刺激，以增强其胶原合成能力，使其分化为肌腱细胞，这种分化细胞能表达肌腱细胞标志物如肌腱蛋白C和肌腱调节蛋白。肌腱细胞接种到聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架上后，能在支架上附着、生长和增殖， 并分泌细胞外基质。将接种有肌腱细胞的支架移植到小鼠的背部皮下，没有畸胎瘤产生，肌腱细胞形成表面光滑的白色肌腱组织。在这种肌腱组织中，肌腱细胞位于支架轴上，随后支架降解，出现纵向排列的胶原纤维和细胞结构。与天然髌骨肌腱相比，pESCs产生的肌腱中胶原纤维直径更小，结构更松散，这可能是由于移植的皮下部位缺乏机械刺激的缘故。pESCs分化来的肌腱细胞可在体内形成肌腱组织，为肌腱损伤的治疗提供了一种思路[18]。

4 分化成心肌细胞

小鼠pESCs可分化为心肌细胞，心肌细胞移植到主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）匹配小鼠的肾包膜后，能自发搏动28 d。若将这种心肌细胞移植到MHC不匹配小鼠的肾包膜，只能自发搏动7 d。将心肌细胞和灭活的小鼠胚胎成纤维细胞混合，加入胶原和培养基制成细胞混合液，然后将混合液加进4个环形模具组成的培养器皿，胶原凝固后，制成工程化心肌（engineered heart muscles，EHMs）。在EHMs中，心肌细胞呈各向异性排列，有自发收缩特性，对细胞外钙浓度上升产生正性肌力反应。将小鼠EHMs与小鼠脾细胞和T细胞共培养，用干扰素γ进行刺激，未引起共培养系统中这些免疫细胞的增殖[19]。用胰岛素样生长因子II（insulin-like growth factor-II， IGF-II）过表达载体对小鼠pESCs进行转染，生成IGF-II过表达的pESCs。IGF-II的過表达能促进pESCs向心肌细胞分化和成熟，将这些心肌细胞移植到患急性心肌梗死的小鼠心脏后，可改善其心功能指数，减少梗死区的胶原沉积和线粒体损伤，促进线粒体生成，表明pESCs分化来的心肌细胞可改善心肌梗死后的病理变化和心脏功能，从而为心肌再生治疗提供了一条重要途径[20]。

5 分化成神经干细胞和神经元

细胞治疗作为一种治疗帕金森病的方法，已经引起人们的极大兴趣。胎儿神经组织移植可改善帕金森病的症状，但这种组织的来源有限，而且胎儿神经组织移植在伦理上也存在争议。pESCs来源于未受精卵子，为帕金森病的治疗提供了一种很好的选择。将人pESCs分化为神经干细胞（human parthenogenetic stem cell-derived neural stem cells，hpNSCs）后，选择患有神经毒素导致的中重度帕金森病的猴作受体，将hpNSCs注射到免疫抑制猴的纹状体和黑质中，动物对手术的耐受性良好，注射的细胞既没有形成肿瘤，也不会迁移到肺、心、肝等其他器官。hpNSCs在整个纹状体和黑质中迁移和植入，并通过胼胝体迁移到对侧大脑半球，其分化产生的多巴胺能神经元可改善帕金森病的症状[21]。除了猴外，患有创伤性脑损伤（traumatic brain injury， TBI）的大鼠也被用作hpNSCs的受体，进行细胞移植治疗研究。将hpNSCs注入TBI大鼠的大脑皮层后，hpNSCs可以迁移并植入TBI的周围区域，产生抗炎反应，减轻炎症对神经元的继发性损伤，增强神经元的存活力，减少反应性胶质细胞的增生，增加与神经谱系和髓鞘形成相关的表型表达，从而促进神经元修复。hpNSCs移植后，TBI大鼠在抬高身体的摇摆试验中摆动偏差减少，前爪抓握能力增强，肢体失用症状得以改善，在放射臂水迷宫测试中空间认知的犯错也减少，说明hpNSCs移植可以改善TBI大鼠的运动和认知缺陷，从而为TBI的细胞疗法研究开辟一条重要途径[22]。

大脑皮层对大脑的高级功能至关重要，成体动物的大脑皮层难以通过神经发生方式来补偿因损伤导致的神经元损失。小鼠pESCs能分化成具有电生理活性的谷氨酸能神经元，这些功能性神经元移植到成体小鼠的受损大脑后，能整合到大脑皮层中，而且其发出的轴突具有皮质神经元的投射模式，在宿主脑中能发送轴突投射，从而有利于大脑皮层的修复[23]。除了小鼠pESCs，人pESCs也可分化成神经元，用于疾病的细胞移植治疗研究。将人pESCs分化为神经上皮细胞后，诱导神经上皮细胞继续分化为多巴胺能神经元，此神经元具有电生理活性，能诱发动作电位和细胞电流。将这些神经元移植到患帕金森病的猴的纹状体中，移植体能在猴脑中存活、迁移和植入，不会形成肿瘤。猴的运动功能在细胞移植后得以改善，而且这种改善至少持续24个月，说明移植的细胞在受体大脑中能发挥长时间的功能，从而缓解疾病症状[24]。

6 结语

pESCs由孤雌激活的卵子制备而来，避免了通过破坏受精胚胎来获得胚胎干细胞所带来的有关伦理方面的问题。pESCs能大量增殖，可扩增足够数量的细胞，供人们对干细胞的移植治疗进行深入研究。pESCs是多能性干细胞，具有高度分化能力，可用于细胞移植治疗研究。尽管pESCs为这些研究提供了一种重要的细胞来源，但在细胞治疗时，需要防止畸胎瘤的发生，减少移植后细胞的死亡率，增强移植细胞的存活率。pESCs包括二倍体pESCs和单倍体pESCs，对它们的分化能力和细胞移植治疗效果需要加以比较。pESCs除了分化成上述分化细胞外，若分化成其他种类的细胞，这些细胞的移植治疗效果如何，也需要进行研究。另外，人们已以动物为模型，将人pESCs的分化细胞移植给这些动物来进行细胞移植治疗研究。但如果这些细胞移植给人，它的安全性怎样，有效性如何，还有待进行研究。

参考文献：

[1]CHOI K H， LEE D K， OH J N， et al. Pluripotent pig embryonic stem cell lines originating from in vitro-fertilized and parthenogenetic embryos[J]. Stem Cell Research， 2020， 49： 102093.

[2]YE G， SUN M， LIN S， et al. Uniparental parthenogenetic embryonic stem cell derivatives adaptable for bone and cartilage regeneration[J]. Biochimica et Biophysica Acta-molecular Cell Research， 2023， 1870（1）： 119379.

[3]ZHONG C Q， ZHANG M L， YIN Q， et al. Generation of human haploid embryonic stem cells from parthenogenetic embryos obtained by microsurgical removal of male pronucleus[J]. Cell Research， 2016， 26（6）： 743-746.

[4]MAI Q Y， MAI X Y， HUANG X， et al. Imprinting status in two human parthenogenetic embryonic stem cell lines： analysis of 63 imprinted gene expression levels in undifferentiated and early differentiated stages[J]. Stem Cells and Development， 2018， 27（6）： 430-439.

[5]SAGI I， DE PINHO J C， ZUCCARO M V， et al. Distinct imprinting signatures and biased differentiation of human androgenetic and parthenogenetic embryonic stem cells[J]. Cell Stem Cell， 2019， 25（3）： 419-432.

[6]LIU W G， YAN X R， LIU W， et al. Alterations of protein glycosylation in embryonic stem cells during adipogenesis[J]. International Journal of Molecular Medicine， 2018， 41（1）： 293-301.

[7]LIANG R， WANG Z Q， KONG X Y， et al. Differentiation of human parthenogenetic embryonic stem cells into functional hepatocyte-like cells[J]. Organogenesis， 2020， 16（4）： 137-148.

[8]TIAN C L， LIU L L， ZENG M， et al. Generation of developmentally competent oocytes and fertile mice from parthenogenetic embryonic stem cells[J]. Protein Cell， 2021， 12（12）： 947-964.

[9]JOHANNSEN H， MUPPALA V， GRSCHEL C， et al. Immunological properties of murine parthenogenetic stem cells and their differentiation products[J]. Frontiers in Immunology， 2017， 8： 924.

[10]TAO H Y， CHEN X N， WEI A B， et al. Comparison of teratoma formation between embryonic stem cells and parthenogenetic embryonic stem cells by molecular imaging[J]. Stem Cells International， 2018， 2018： 7906531.

[11]KIM S， LEE S K， KIM H， et al. Exosomes secreted from induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells accelerate skin cell proliferation[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2018， 19（10）： 3119.

[12]KIM Y J， SEO D H， LEE S H， et al. Conditioned media from human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells stimulate rejuvenation function in human skin[J]. Biochemistry Biophysics Reports， 2018， 16： 96-102.

[13]RAO Y， CUI J H， YIN L， et al. Preclinical study of mouse pluripotent parthenogenetic embryonic stem cell derivatives for the construction of tissue-engineered skin equivalent[J]. Stem Cell Research & Therapy， 2016， 7（1）： 156.

[14]DEBNATH S， YALLOWITZ A R， MCCORMICK J， et al. Discovery of a periosteal stem cell mediating intramembranous bone formation[J]. Nature， 2018， 562（7725）： 133-139.

[15]MURPHY M P， KOEPKE L S， LOPEZ M T， et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells[J]. Nature Medicine， 2020， 26（10）： 1583-1592.

[16]HARVEY T， FLAMENCO S， FAN C M. A Tppp3+Pdgfra+ tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis[J]. Nature Cell Biology， 2019， 21（12）： 1490-1503.

[17]KOMURA S， SATAKE T， GOTO A， et al. Induced pluripotent stem cell-derived tenocyte-like cells promote the regeneration of injured tendons in mice[J]. Scientific Reports， 2020， 10（1）： 3992.

[18]LIU W， YIN L， YAN X R， et al. Directing the differentiation of parthenogenetic stem cells into tenocytes for tissue-engineered tendon regeneration[J]. Stem Cells Translational Medicine， 2017， 6（1）： 196-208.

[19]DIDI M， GALLA S， MUPPALA V， et al. Immunological properties of murine parthenogenetic stem cell-derived cardiomyocytes and engineered heart muscle[J]. Frontiers in Immunology， 2017， 8： 955.

[20]SUI Y， ZHANG W， TANG T， et al. Insulin-like growth factor-II overexpression accelerates parthenogenetic stem cell differentiation into cardiomyocytes and improves cardiac function after acute myocardial infarction in mice[J]. Stem Cell Research & Therapy， 2020， 11（1）： 86.

[21]GONZALEZ R， GARITAONANDIA I， POUSTOVOITOV M， et al. Neural stem cells derived from human parthenogenetic stem cells engraft and promote recovery in a nonhuman Primate model of parkinsons disease[J]. Cell Transplantation，  2016， 25（11）： 1945-1966.

[22]LEE J Y， ACOSTA S， TUAZON J P， et al. Human parthenogenetic neural stem cell grafts promote multiple regenerative processes in a traumatic brain injury model[J]. Theranostics， 2019， 9（4）： 1029-1046.

[23]VARRAULT A， ECKARDT S， GIRARD B， et al. Mouse parthenogenetic embryonic stem cells with biparental-like expression of imprinted genes generate cortical-like neurons that integrate into the injured adult cerebral cortex[J]. Stem Cells， 2018， 36（2）： 192-205.

[24]WANG Y K， ZHU W W， WU M H， et al. Human clinical-grade parthenogenetic ESC-derived dopaminergic neurons recover locomotive defects of nonhuman primate models of Parkinsons disease[J]. Stem Cell Reports， 2018， 11（1）： 171-182.