白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢的代谢组比较分析

史绍琪，陈金甜，林毓娥，谢国源，黄美华，王 敏

（1.广东省农业科学院蔬菜研究所/广东省蔬菜新技术研究重点实验室，广东 广州 510640；2.广宁县江屯镇农业技术推广中心，广东 广宁 526334；3.广宁县农业农村局，广东 广宁 526300；4.肇庆市农业科学研究所，广东 肇庆 526000）

【 研究意义】 佛手瓜（Sechium eduleSwartz）为葫芦科佛手瓜属多年生宿根性攀援植物，广泛分布于热带及温带地区，是一种常见的瓜类蔬菜［1］。佛手瓜原产于墨西哥，19 世纪初传入我国台湾地区，目前在广东、云南、浙江、福建、台湾等地广泛种植［2-3］。佛手瓜是一种营养丰富的珍稀蔬果，具有舒肝理气、和胃止痛、美容养颜和扩张血管、降压的功效［4-5］。龙须菜是佛手瓜的嫩梢，20 世纪80 年代末，广东肇庆广宁县开始种植［6-7］，其口感爽脆、风味独特，兼具助消化、清热解毒等保健作用，富含维生素B、维生素C、胡萝卜素、总黄酮和矿质元素［8-10］，龙须菜鲜苗中含有丰富的蛋白质以及钙、铁、硒等元素，其含量均高于其他蔬菜［11］。虽然龙须菜营养价值较高，但有关其代谢组学研究方面尚未见报道。【前人研究进展】代谢组学（Metabonomics）可用于代谢途径或代谢网络解析，是定量评价果蔬品质的有效途径之一［12-14］。目前，代谢组学已在水稻［15-16］、玉米［17］、拟南芥［18］、番茄［19］、莴苣［20］、大豆［21］和甜瓜［22］等作物得到应用，并为其他物种代谢物积累模式和遗传基础研究提供参考。研究者从表型与脂质分子层面对不同花生品种进行品质鉴评，最终筛选到3类31 种核心差异脂质分子，在花生品种鉴定中发挥关键作用［23］。赤霞珠是酿酒葡萄的主要栽培品种，研究者对赤霞珠果皮不同砧穗组合进行代谢组分析，成功鉴定出赤霞珠葡萄6 种砧穗组合特征标志物，为葡萄砧木良种选育提供方向［24］。研究发现，蔗糖、葫芦素、脂质等差异代谢物可作为标记性物质区分不同类型西瓜品种，为西瓜育种奠定基础［25］。不同瓠瓜果实间存在较大的代谢物差异，脂质、氨基酸、黄酮类物质综合影响瓠瓜果实鲜味［26］。【本研究切入点】白皮和江屯青皮佛手瓜的果实皮色差异明显，但其嫩梢表型差异肉眼无法辨别，且嫩梢的代谢物组成和含量尚未见报道。【拟解决的关键问题】本研究以白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢为材料，鉴定不同龙须菜品种中差异代谢物质，为佛手瓜嫩梢的品质改良和有效利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为成熟期白皮和江屯青皮佛手瓜，由肇庆市广宁县江屯镇富竹庄园生态农场提供。2021 年春季，种植于广东省农业科学院蔬菜研究所白云试验基地。首先将成熟期白皮和江屯青皮佛手瓜整瓜分别种植于营养钵中，常规栽培管理，发芽后移栽至大田；主茎长至15 节左右时，分别摘取约3 cm 左右顶端新鲜嫩梢置于液氮中，每个品种选取9 个单株，摘取嫩梢，3 次重复，保存在-80℃冰箱。江屯青皮佛手瓜嫩梢（LXCB）作为对照，白皮佛手瓜嫩梢（LXCW）作为试验组进行差异代谢物等数据分析。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备 将样品置于冻干机（Scientz-100F）中真空冷冻干燥；利用研磨仪（MM 400、Retsch）研磨（30 Hz，1.5 min）至粉末状；称取100 mg 粉末，在1.2 mL 70%甲醇提取液中溶解；每30 min 涡旋一次，每次持续30 s，6 次重复，样本置于4℃冰箱过夜；12 000 r/min 转速离心10 min，吸取上清液，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤样品，将样品保存至进样瓶中，用于UPLC-MS/MS 分析。样品（名称分别为LXCW1、LXCW2、LXCW3 以及LXCB1、LXCB2、LXCB3）送至武汉迈维维尔生物科技有限公司进行广泛靶向代谢组检测。

1.2.2 色谱质谱 数据采集仪器系统包括超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）超高性能液相色谱分析仪（SHIMADZU Nexera X2）和串联质谱（Tandem mass spectrometry，MS/MS）、4500 QTRAP 串 联质谱仪（Applied Biosystems 4500 QTRAP）。

液相条件：色谱柱为Agilent SB-C18 柱（1.8 µm，2.1 mm×100 mm）；流动相A 为0.1%甲酸超纯水溶液，流动相B 为加入0.1%甲酸的乙腈溶液；洗脱梯度为0 min 时，B 相比例为5%，9 min 内B 相比例线性增加到95%，持续1 min，10～11 min B 相比例降为5%，并平衡至14 min；柱温40 ℃；流速0.35 mL/min；进样量4 μL。

质谱条件主要包括：使用三重四极杆线性离子阱质谱仪（QTRAP），AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS 系统，该系统配备了ESI Turbo 离子喷雾接口，采用正负两种离子模式进行数据采集。ESI源操作参数如下：离子喷雾电压（IS）5 500 V（正离子模式）/-4500 V（负离子模式）；离子源，涡轮喷雾；源温度550 ℃；离子源气体I（GSI），气体Ⅱ（GS Ⅱ）和气帘气（CUR）分别设置为50、60、25.0 psi，碰撞诱导电离参数设置为高。三重四极杆扫描使用MRM模式，并将碰撞气体（氮气）设置为中等。

1.3 数据分析

利用软件Analyst 1.6.3 处理质谱数据，再进行主成分（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA），利用R 软件中的MetaboAnalystR包OPLSR.Anal 函数进行分析；代谢物含量数据采用归一化处理（Unit Variance Scaling，UV Scaling），通过R 软件ComplexHeatmap 包绘制热图，对代谢物在不同样本间的积累模式进行层次聚类分析（Hierarchical Cluster Analysis，HCA）。

2 结果与分析

2.1 两个佛手瓜品种嫩梢代谢组轮廓

利用MRM（三重四级杆质谱的多反应检测模式）和MultiaQuant 软件对白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢混合样本进行数据采集和分析。结果表明，总离子流曲线重叠性高，即保留时间和峰强度一致，表明质谱对同一样品的不同时间检测信号稳定性较好。

通过对白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢进行广泛靶向代谢组学检测，共检测到787 种代谢物，采用主成分分析建模方法对所鉴定代谢物进行分析。结果表明，当PC1为51.49%、PC2为19.75%时，不同品种能够明显分开，同一品系样本没有明显分离，3 次重复数据能较好地集中，白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢代谢物明显分离（图1）。

图1 两个佛手瓜品种嫩梢PCA 得分Fig.1 Score plot of PCA analysis of the tender tips of two varieties of Sechium edule

2.2 两个佛手瓜品种嫩梢差异代谢物筛选和鉴定

基于OPLS-DA 结果和差异倍数值（Fold Change，FC）分析，发现白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢中差异显著代谢物共有135 种。与江屯青皮佛手瓜嫩梢相比，白皮佛手瓜嫩梢中显著上调53种，包括脂质18 种、酚酸类11 种、黄酮7 种、核苷酸及其衍生物6 种、氨基酸及其衍生物4 种和其他7 种代谢物；显著下调代谢物为82 种，包括黄酮29 种、脂质31 种、生物碱7 种、酚酸类5 种和其他10 种代谢物（表1）。

表1 白皮佛手瓜与江屯青皮佛手瓜嫩梢部分显著差异的代谢物 Table 1 Metabolites with significant differences between the tender tips of white Sechium edule and Jiangtun cyan Sechium edule

2.3 两个佛手瓜品种嫩梢差异代谢物聚类分析

采用聚类分析方法对两个佛手瓜品种嫩梢进行差异代谢物分析。结果表明，白皮佛手瓜嫩梢中的芥子醛、松柏醇、苜蓿素-7-O-（2''-芥子酰）葡萄糖苷、5-羟基-7,8,2'，6'-四甲氧基黄酮、二氢双去甲氧基姜黄素、十八碳二烯-6-炔酸、9-羟基过氧-10E,12,15Z-十八碳三烯酸、1-O-葡萄9 糖基芥子酸、香草醛;4-羟基-3-甲氧基苯甲醛、9-羟基-13-氧代-10-十八碳烯酸等代谢物含量比江屯青皮嫩梢高。江屯青皮佛手瓜嫩梢中的溶血磷脂酰乙醇胺16 ∶3、溶血磷脂酰胆碱16 ∶1、N',N''-二阿魏酰亚精胺、日当药黄素、吲哚-3-氰基-2-O-葡萄糖苷、3-O-对香豆酰奎宁酸-O-葡萄糖苷、腺嘌呤核苷三磷酸、溶血磷脂酰乙醇胺18 ∶1、山奈酚-3,7-O-二鼠李糖苷（山奈苷）、溶血磷脂酰胆碱18 ∶1 含量较高（图2）。

图2 两个佛手瓜品种嫩梢差异代谢物聚类分析Fig.2 Cluster analysis of differential metabolites in tender tips of two varieties of Sechium edule

2.4 两个佛手瓜品种嫩梢差异代谢物代谢途径分析

根据差异代谢物聚类分析结果，开展KEGG通路富集分析。结果显示，差异代谢物主要显著富集在嘌呤代谢、亚油酸新陈代谢、类黄酮生物合成、各种次生代谢产物生物合成和亚麻酸新陈代谢5 条途径中（图3）。嘌呤代谢富集6 种物质，包含3'-腺嘌呤核苷酸、次黄嘌呤、腺嘌呤核苷三磷酸、腺苷-5'-单磷酸、腺苷和鸟苷 5'-单磷酸，占比16.22%；亚油酸新陈代谢富集7 种物质，包括9S-羟基-10E,12Z-十八碳二烯酸、13-羟基十八烷基-9,11-二烯酸、9(S),12(S),13(S)-三羟基-10(E)-十八烯酸、13-氢过氧化-9,11-十八碳二烯酸、9,10-环氧十八烯酸、9S-氢过氧-10E,12Z-十八碳二烯酸和9,10,13-三羟基-11-十八碳烯酸，占比18.92%；类黄酮生物合成富集5 种物质，包含3-O-乙酰短叶松黄烷酮、3,4,2',4',6'-五羟基查耳酮-4'-O-葡萄糖苷、圣草酚、5-O-对香豆酰奎宁酸和短叶松素，占比13.51%；各种次生代谢产物生物合成富集5种，包含松脂醇、腺嘌呤核苷三磷酸、香草醛；4-羟基-3-甲氧基苯甲醛、松柏醇和邻氨基苯甲酸，占比13.51%；α-亚麻酸新陈代谢富集3 种，包含13S-羟基-9Z,11E,15Z-十八碳三烯酸、9-羟基过氧-10E,12,15Z-十八碳三烯酸和9-羟基-12-氧代-10(E),15(Z)-十八碳二烯酸，占比8.11%。

图3 两个佛手瓜品种嫩梢差异代谢物KEGG 富集Fig.3 Differential metabolite KEGG enrichment of tender tips of the two varieties Sechium edule

3 讨论

代谢组学在植物学、医学、食品科学、农业害虫防治等领域都得到广泛应用［27-29］，利用代谢组学方法可以将代谢物的种类与含量、生物表型变化建立更直接的联系［30］。伍海航等［31］利用多组学技术研究了药用植物中次生代谢调控，分析了多组学联用与黄酮类、生物碱类等成分间的次生代谢物差异，进一步解析了药用植物调控网络。杜尚广［32］利用代谢组学分析两种水稻在寒冷条件下代谢物差异，发现糖类和氨基酸类物质响应两种水稻的低温胁迫，并为水稻抗寒品种选育提供理论依据。袁平丽［33］对不同西瓜果实代谢物进行检测，发现西瓜栽培种和野生种的代谢轮廓存在明显差异，在驯化过程中糖类物质和类胡萝卜素含量逐渐升高，抗营养类物质含量逐渐减少，为优质西瓜新品种选育提供了思路。

研究表明，脂质类溶血磷脂酰乙醇胺可以缓解肠道炎症，通过增加肠道上皮屏障的稳定性，缓解或治疗肠炎和炎症性肠病［34］；生物碱亚精胺类物质具有镇痛、降血压以及抗抑郁等作用［35］；酚酸类腺嘌呤核苷三磷酸可以保护心肌细胞［36］，这些物质可能是佛手瓜具有降血压等药用价值的关键。与白皮佛手瓜嫩梢相比，青皮佛手瓜嫩梢中含有丰富的溶血磷脂酰乙醇胺、阿魏酰亚精胺以及腺嘌呤核苷三磷酸，药用价值更高。

黄酮类是果实鲜味的关键物质，具有抗菌、抗氧化活性功能［37］。研究表明，淡竹叶中日当药黄素含量较高，可以抑制黑色素积累，具有较强的抗氧化活性［38-39］，本研究发现江屯青皮与白皮佛手瓜嫩梢山奈苷、日当药黄素均有显著性差异，二者皆属于黄酮类，推测其具有一定的抗氧化能力，可能参与调控佛手瓜的鲜味，影响其营养品质。江屯青皮佛手瓜嫩梢含有更为丰富的黄酮类物质，在鲜味、抗氧化等品质方面更好。

4 结论

本研究通过代谢组学比较白皮和江屯青皮佛手瓜嫩梢的差异代谢物，共筛选到135 种显著差异物质，差异倍数log2处理后，溶血磷脂酰乙醇胺和日当药黄素log2FC 值分别为-19.21 和-14.31，表明江屯青皮龙须菜富含脂质和黄酮类物质，特别是溶血磷脂酰乙醇胺、日当药黄素等，为解析青皮龙须菜代谢组学的营养价值以及辅助龙须菜的品种选育提供理论基础。