慢病毒介导稳定表达Cas9 蛋白的鸡成纤维细胞系构建及其活性验证

李晓娇，朱新宇，邹 娴，严 霞，何燕华，罗成龙

（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东 广州 510225；2.广东省农业科学院动物科学研究所/畜禽育种国家重点实验室/广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东 广州 510640）

【研究意义】基因编辑技术对高效获得特定表型的畜禽新品种具有重要意义，而畜禽功能基因的挖掘和开发是选育新品种的重要手段。成簇的规律间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas9）是当前应用最广泛的基因编辑技术［1-2］。近年来，通过应用CRISPR/Cas9 技术对哺乳动物细胞、活体进行精确基因编辑和基因功能研究，显著加快了生物学、医学相关研究的效率。基于CRISPR/Cas9 的基因工程技术与细胞工程技术相结合，可以不断挖掘动物的功能基因，丰富动物遗传资源，推进动物育种进程。本研究建立稳定表达Cas9 蛋白的鸡成纤维细胞系（DF-1）将有利于推进鸡功能基因的挖掘工作，对加快明确鸡育种进程的主效基因具有重要意义。【前人研究进展】CRISPR/Cas9 系统中sgRNA 引导Cas9 蛋白造 成DNA 双链断裂（Double-Strand Breakage，DSB），并诱导DNA 自我修复，包括同源重组修复（Homology Directed Repair，HDR）、非同源末端链接（Non-homologous End Joining，NHEJ）和单链退火（Single-stranded Annealing,SSA）3 种方式［3-4］。利用DNA 自我修复的特性，可在DSB时精确敲除、插入或替换特定的碱基。CRISPR/Cas9 技术具有高效、应用简单且成本低的优点，因此在动物和植物的遗传育种研究中发挥重要作用［5-7］。为了快速确认CRISPR/Cas9 系统的编辑能力，一般采用报告系统便于结果的观察［8-9］。SSA 修复机制是一种重要的DNA 重组方式，双链DNA 断裂产生3'ss DNA 悬臂末端，当两端存在同向的同源序列时，同源序列与悬臂末端通过碱基互补配对拟合在一起，再经过核酸内切酶切除多余的3'末端、聚合酶补齐双链缺口、连接酶连接最终完成修复。近年来基于SSA 修复机制的报告系统相继被报道［9-13］，其修复效率比NHEJ高10 倍［14］。Oishi 等［15］在禽细胞上利用SSA 报告载体判断sgRNA 活性，针对卵清蛋白（OVA）和卵胞浆样蛋白（OVM）分别设计4 条sgRNA，将Cas9 蛋白和sgRNA 共表达载体与SSA 报告载体共同转染293T 细胞，快速筛选出活性最好的sgRNA 序列，在后续研究中用于产生基因编辑鸡，且无出现脱靶效应。黄思嘉等［16］通过双荧光报告载体试验证明了成对敲除载体的工作效率远高于单敲除载体，采用成对的AMHR2敲除载体共转染DF-1 细胞，结果显示AMHR2基因的突变率达到60%。【本研究切入点】应用SSA 报告系统是快速检测sgRNA 活性的有效手段，而在鸡细胞上利用SSA 报告载体检测稳转Cas9 细胞系活性还未见报道。获得有稳定切割活性的稳转Cas9蛋白细胞系非常重要，在稳转细胞系中同时引入SSA 报告载体系统和sgRNA 表达载体，sgRNA 能快速引导Cas9 蛋白切割SSA 报告载体中的靶片段，从而快速判断Cas9 核酸酶活性，得到具有活性的稳转Cas9 蛋白的细胞系。【拟解决的关键问题】与哺乳动物细胞系相比，鸡DF-1 细胞转染效率较低，通过慢病毒感染DF-1 细胞筛选稳转Cas9 的阳性细胞，并结合SSA 报告载体验证其活性，可为后续在DF-1 细胞上开展高通量筛选以及功能基因验证奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

DF-1、293T、DF-1-EGFP-Cas9 细胞和DH5α感受态细胞由广东省农业科学院动物科学研究所保存；Lenti-Blast-Cas9、psPAX2、PMD2.G由华中农业大学动物科技学院赠送，pYP152、pCMV-SSA-mCherry-HindⅢ由中国科学院上海生命科学研究院神经科学研究所赠送。转染试剂LipofectamineTM3000、杀稻瘟菌素（Blasticidin，下文简写为Blast）、限制性内切酶BbsⅠ、Hind Ⅲ以及细胞培养用的基础培养基DMEM、PBS 缓冲液和细胞培养胎牛血清（FBS）购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司，慢病毒感染增强试剂聚凝胺Polybrene 购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；AG 高保真DNA 聚合酶购于湖南艾科瑞生物工程有限公司，In fusion 同源重组酶和DNA Ligation Mix 购于宝日医生物技术（北京）有限公司，质粒中量提取试剂盒购于Omega Bio-tek广州飞扬生物工程有限公司，血液/细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒和琼脂糖凝胶核酸纯化回收试剂盒购于天根生化（北京）科技有限公司，LB 肉汤购于环凯微生物有限公司，氨苄青霉素购于北京索莱宝科技有限公司，Cas9 蛋白抗体购于艾博抗（上海）贸易有限公司，HRP 标记的山羊抗兔IgG 购于赛信通（上海）生物试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养 293T 细胞和DF-1 细胞均以含10% FBS 的DMEM 培养基为完全培养基，分别置于37 ℃、含5% CO2的培养箱和39 ℃、含5% CO2的培养箱中培养。

1.2.2 Blast 工作浓度筛选 在6 孔板上接种DF-1 细胞，当细胞长至密度为80%～90%时加入含有Blast 的完全培养基（DMEM+10%FBS），将1 mg/mL 的Blast 溶液用不加抗生素的完全培养基分别稀释为0、2、4、6、8、10 µg/mL，每天观察细胞生长状态，每隔48 h 更换1 次新鲜的筛选培养基。

1.2.3 稳转Cas9 的DF-1 细胞构建 将293T细胞铺板在10 cm 培养皿上，生长至密度为70%～80% 时转染。按 照LipofectamineTM3000 转染试剂说明书转染慢病毒三质粒系统，转染质粒的总量为24 µg，3 种质粒的比例为Lenti -Blast-Cas9 ∶psPAX2 ∶PMD2.G=3 ∶2 ∶1，转染前更换新鲜的完全培养基，转染6 h 后换液，并分别在转染48、72 h 后收集慢病毒上清液，-80℃保存。之后将DF-1 细胞接种于6 孔板，生长至密度为40%左右用慢病毒感染细胞，慢病毒∶完全培养基=1 ∶1，加入终浓度为8 µg/mL 的Polybrene 进行培养，以不加入慢病毒为对照。感染24 h 后换为完全培养基，48 h 后加入最适工作浓度Blast 的完全培养基，隔天换液，直至对照处理细胞全部死亡。之后更换为含最适抗生素浓度1/2 的完全培养基继续培养细胞。

1.2.4 单克隆细胞株的筛选 采用有限稀释法筛选单克隆细胞株。用0.1%胰蛋白酶消化单层DF-1 细胞，制成细胞悬液，用完全培养基将细胞稀释成1 000 cell/mL 后，取200 μL 细胞悬液加入96 孔板的A1 孔，其他孔加入100 μL 含2 μg/mL Blast 的筛选培养基，吸取100 μL A1 孔的细胞加至A2 孔，以此类推稀释到A8 孔。再向A1～A8 孔各加入100 μL 培养基，混匀后分别取100 μL 加入B1～B8 孔，逐步稀释至L1～L8 孔。观察选择只有单个细胞的孔，继续培养2～3 周，当细胞长满后在48 孔板扩大培养，依次传代到12孔板、6 cm 皿、10 cm 皿并冻存细胞。

1.2.5 PCR 扩 增Cas9 核酸酶DNA 片段用SnapGene 软件分析Lenti-Blast-Cas9 慢病毒载体图谱和序列（图1），针对载体中的Cas9 蛋白设计引物（Lenti Cas9-F：5'ATGGACAAGAAGTAC AGCATCGGC3'；Lenti Cas9-R：5'ACAGGTC GATCCGTGTCTCGTA3'），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。提取单克隆细胞株的基因组DNA，进行PCR 扩增Cas9 片段，PCR 反应体系参考AG 高保真DNA 聚合酶说明书，反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸4 min，共35个循环。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

图1 Lenti-Blast-Cas9 载体图谱Fig.1 Lenti-Blast-Cas9 vector map

1.2.6 Western blot 验 证Cas9 蛋白表达将阳性单克隆细胞在6 孔板中传代，同时设置阴性和阳性对照，其中阴性对照为没有做任何处理的DF-1 细胞，阳性对照为DF-1-EGFP-Cas9 细胞，培养48 h 后弃去培养基，用PBS 清洗2 次，然后分别在细胞中加入配制好的RIPA 蛋白裂解液，在冰上裂解20 min 后加入5×上样缓冲液，在100 ℃金属浴中变性10 min。之后用8% SDSPAGE 分离胶于90 V 下恒压电泳2 h 分离蛋白样品，300 mA 恒流转膜2 h，室温下用含5%BSA的TBST 封闭1 h，一抗在4℃下过夜孵育（一抗稀释比例为1 ∶20 000），用1× TBST 洗膜3 次后在常温下孵育二抗（二抗稀释比例为1 ∶5 000），洗膜3 次后显影观察结果，用Image J软件分析目的蛋白和内参蛋白灰度值，计算Cas9蛋白相对表达量，用GraphPad Prism 9 软件绘制散点图。

1.2.7 sgRNA 表达载体构建在 线（http://crispor.tefor.net/）设计靶向OVA基因的sgRNA序列，引物（OVAsgRNA top：5'caccGCCATGCCAAT GAGAACATCT3'，OVAsgRNA bottom：5'aaacAGA TGTTCTCATTGGCATGGC3'，小写字母 为BbsⅠ粘性末端）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，纯化方式为PAGE。用ddH2O 将引物稀释到100 nmol/mL，在PCR 管中加入引物对各5 µL，在PCR 仪中退火形成寡聚核苷酸链，退火程序为95℃ 5 min、65℃ 1 h。sgRNA 表达载体以pYP152 为骨架，在U6 启动子后带有BbsⅠ酶切位点，用于插入sgRNA 序列。将pYP152 载体用BbsⅠ在37℃下酶切1 h，线性化后用5 µL DNA Ligation Mix 连接sgRNA 退火产物，反应条件为16℃ 1 h。将连接产物转化DH5α、涂板，第2 天挑菌送出测序。

1.2.8 SSA 报告载体构建 SSA 修复机制可以快速灵敏地检测稳转Cas9 细胞株的切割活性，依赖于同源重组的SSA 修复机制如图2 所示。

图2 SSA 修复过程示意图Fig.2 SSA repair process schematic diagram

SSA报告载体以pCMV-SSA-mCherry-HindⅢ为骨架，用软件snapGene 设计OVA靶片段引物，该片段需要包含OVAsgRNA 序列，并添加报告载体pCMV-SSA-mCherry-Hind Ⅲ 的酶切位点两端15 bp 同源臂（OVASSA F：5'caggactcctccctgA TCCTTACATTTTCACTGTTCTGCTG3'，OVASSA R：5'ccttggtcaccttcaCCTCTGAGCTATGCAGTTTCC AA3'，小写字母为Hind Ⅲ酶切位点两端15 bp 同源臂）。PCR 扩增OVA靶片段，反应程序为：95℃预变性3 min；95 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35 个循环。对报告载体用Hind Ⅲ在37℃下酶切15 min，用天根DNA 回收试剂盒纯化靶片段PCR 产物和报告载体酶切产物，之后用In fusion 酶连接，连接体系为：PCR纯化产物200 ng、酶切产物50 ng、5× In-fusion HD Enzyme Premix 2 μL，补水至10 μL，在50℃下反应15 min，连接产物转化DH5α 感受态细胞，涂板，第2 天挑选单克隆菌送出测序。

1.2.9 DF-1 稳转Cas9 蛋白细胞培养与转染 对稳转Cas9 蛋白的DF-1 细胞用含2 µg/mL Blast 的筛选培养基在39℃下培养，细胞长满后将细胞接种到24 孔板，当细胞密度达到70%～80%左右时进行转染试验，转染试剂为LipfectamineTM3000，按照说明书操作，sgRNA 表达载体和SSA 报告载体比例为1 ∶1，总量为1 µg。设置DF-1 仅转染pCMV-OVA-SSA-mCherry-Hind Ⅲ的阴性对照，DF-1 共转Lenti -Blast-Cas9、pYP152-OVAsgRNA 以 及pCMV-OVA-SSA-mCherry-Hind Ⅲ的阳性，其他4 株单克隆细胞株共转pYP152-OVAsgRNA 和pCMV-OVA-SSA-mCherry-Hind Ⅲ，转染48 h 后在荧光显微镜下观察荧光。

2 结果与分析

2.1 Blast 最佳工作浓度

用含有不同浓度Blast 的培养基培养DF-1 细胞，以培养7 d 后细胞全部死亡的Blast 浓度为DF-1 稳转Cas9 细胞株筛选的最适工作浓度，结果（图3）表明，Blast 浓度为4 µg/mL 时，培养7 d 后细胞全部死亡，因此，选择4 µg/mL 为Blast的最适工作浓度。

图3 不同浓度Blast 培养DF-1 细胞7 d 后的细胞状态（4×）Fig.3 Cell status of DF-1 cells after 7 days of culture with different concentrations of Blast (4×)

2.2 单克隆细胞株的筛选

利用含4 μg/mL Blast 的培养基培养7 d 后阴性对照细胞全部死亡，慢病毒感染组还有少量存活细胞，继续培养3 d 后，换为含2 μg/mL Blast 的培养基维持筛选，再培养1 周后明显观察到慢病毒感染组形成多个单克隆细胞（图4）。用有限稀释法以10 个96 孔板将这些单克隆细胞进行稀释，最终获得27 株单克隆细胞株。

图4 稳定表达Cas9 蛋白的DF-1 阳性细胞Fig.4 DF-1 positive cells of stably expressing Cas9 protein

2.3 单克隆细胞株Cas9 蛋白表达验证

提取单克隆细胞株的DNA，PCR 扩增Cas9核酸酶DNA 片段，琼脂糖凝胶电泳结果显示，单克隆细胞株在4 140 bp 处均有明显的目的条带，而阴性的DF-1 细胞未检测到任何条带（图5A）。提取细胞总蛋白，Western blot 结果表明，挑选的DF-1 稳转株均表达Cas9 蛋白，且DF-1细胞不表达（图5B）。用Image J 分析灰度值后，计算目的蛋白与内参蛋白的比值并做归一化处理，使用GraphPad Prism 9 得到稳转Cas9 蛋白细胞系的Cas9 蛋白表达量散点图（图5C），这些稳转株的Cas9 表达水平均不一致，选择其中几株表达较高的细胞株扩大培养，用于后续的SSA 修复活性检测。

图5 单克隆细胞株Cas9 蛋白表达验证Fig.5 Validation of Cas9 protein expression in a monoclonal cell line

2.4 sgRNA 表达载体与SSA 报告载体的构建

为了构建sgRNA 表达载体，用BbsⅠ酶切pYP152 线性化载体（图6A），与退火的OVAsgRNA 序列相连，转化感受态DH5α 后在氨苄抗性固体培养基上培养，挑取单克隆菌落，由天一辉远生物科技有限公司测序，结果显示OVAsgRNA 序列插入pYP152 载体的位置、方向和序列均正确，成功构建OVAsgRNA 表达载体。PCR扩增OVA靶片段，琼脂糖凝胶电泳验证条带正确，切胶，用试剂盒回收DNA 片段（图6C），与线性化的pCMV-mCherry-SSA-Hind Ⅲ载体连接，转化后挑取单克隆菌落，菌液测序结果与克隆载体进行比对，结果（图6D）显示有408 bp 插入，该OVA靶片段包含正确的sgRNA 序列和对应的PAM 位点，成功构建SSA 报告载体。所构建的pYP152-OVAsgRNA 表达载体和pCMV-OVASSA-mCherry-Hind Ⅲ报告载体用于后续共转检测稳转Cas9 蛋白细胞的切割活性。

图6 sgRNA 表达载体和SSA 报告载体构建结果Fig.6 Construction results of sgRNA expression vector and SSA reporter vector

2.5 基于SSA 报告载体检测稳转细胞株活性

将构建好的sgRNA 表达载体和SSA 报告载体共转稳定表达Cas9 蛋白的DF-1 细胞系，转染48 h 后通过荧光显微镜观察每株细胞的SSA 修复情况。由图7 可见，单转报告载体的细胞不表达红色荧光，说明SSA 报告载体在插入一段外源序列后不表达红色荧光，而瞬时转染慢病毒载体Lenti-Blast-Cas9、sgRNA 表达载体、SSA 报告载体以及其他DF-1 稳转株均有不同程度的红色荧光，表明筛选到的稳转Cas9 蛋白的DF-1 细胞系均可表达Cas9 蛋白，且在sgRNA 的引导下发挥切割DNA 的作用，并诱发细胞的SSA 修复机制，恢复红色荧光。

图7 稳定表达Cas9 蛋白细胞株转染结果(10×) Fig.7 Transfection results of cell lines of stably expressing Cas9 protein (10×)

3 讨论

慢病毒属于逆转录病毒，可以感染处于分裂期和非分裂期的多种类型细胞，常被用于携带大片段的外源基因，在逆转录酶的作用下高效整合到目的细胞基因组中［17］，构成稳定表达外源基因的细胞系。DF-1 细胞作为大多数禽类病毒易感细胞，常被用于研究禽病产生经过和发病机制［18］。本研究使用慢病毒载体Lenti-Blast-Cas9 与其他两个慢病毒辅助质粒，在293T 细胞中转染包装产生Cas9慢病毒，该慢病毒载体携带Blast抗性标签，感染DF-1 细胞后筛选出具有Blast 抗性的稳定表达Cas9 蛋白的细胞，结合SSA 报告载体证明该细胞具有产生DSB 的能力，表明成功构建了稳定表达Cas9 蛋白的DF-1 细胞，这为今后研究鸡的功能基因以及构建鸡全基因组CRISPR/Cas9 敲除细胞库奠定基础。

近年来，基于报告系统检测基因编辑系统中核酸酶、sgRNA 活性的方式逐渐兴起。报告系统通常包括报告细胞和报告载体，其工作原理是利用基因编辑系统在报告基因编码区引起DSB，之后通过NHEJ、HDR 或SSA 修复抑制或者恢复报告基因表达，报告基因可选抗生素抗性基因、荧光蛋白等，可以直观、快速并灵敏地观察结果［14,19］。SSA 修复由同源重组介导且不需要额外引入模板链，在DSB 位点存在重复序列时，双链断裂的末端会暴露单链DNA，这些单链DNA 上的反向重复序列会通过互补配对形成环状DNA 结构，再由内切酶和DNA 聚合酶发挥作用使DNA双链断裂得到修复［20-21］，从而恢复SSA 载体中报告基因的表达［22］。本研究筛选到Blast 阳性单克隆细胞后，为了快速检测稳转Cas9 蛋白细胞的活性，采用SSA 报告系统，实验流程简单，只需将已确定有活性的OVAsgRNA 序列和构建含有OVA靶片段的SSA 报告载体共转染稳定表达Cas9蛋白的细胞，48 h 后即可直接观察到mCherry 恢复表达的情况，SSA 报告载体系统应用于检测核酸酶活性，避免了复杂的实验过程，从而节约时间和成本。

通过基因敲除或插入研究基因功能是必不可少的生物技术手段。CRISPR/Cas9 系统适用于编辑任何细胞类型的基因，目前在人和小鼠方面已经建立了较为成熟的应用体系［23-25］，采用CRISPR/Cas9 系统研究猪的功能基因（如CD163、MSTN等）也已经有突破性进展［26-29］，相关功能基因的敲除均产生了具有特定表型的猪。近年也有利用CRISPR/Cas9 技术进行鸡已知功能基因的研究，研究表明，W38纯合敲除鸡可以抵抗禽白血病侵袭［30］；DMRT1的敲除证明该基因与鸡睾丸发育至关重要［31-32］。目前已知的鸡生长性能、器官发育以及抗病性等相关功能基因还较少。CRISPR/Cas9 系统在禽类研究方面的应用近几年才开始，且面临sgRNA 脱靶、编辑效率低以及CRISPR 递送方式困难等问题［33］。本研究结果表明，SSA 报告载体系统在检测Cas9核酸酶活性方面发挥重要作用。在应用CRISPR/Cas9 进行基因编辑时，往往需要设计多条sgRNA进行验证，最终选择1 条活性最高的sgRNA 进行后续研究［34］，因此后续可以利用SSA 报告载体系统并结合稳转Cas9 蛋白的DF-1 细胞来快速筛选切割效率高的sgRNA。本研究中稳转Cas9 蛋白的DF-1 细胞不仅可以用于功能基因验证，还可用于高通量筛选功能基因。

4 结论

本研究利用慢病毒载体系统获得长期稳定表达Cas9 蛋白的鸡DF-1 细胞系。鉴于SSA 报告载体系统的高效性，本研究构建了SSA 报告载体，结合CRISPR/Cas9 系统的作用快速检测稳转细胞的修复活性。SSA 报告系统结果显示，上述建立的稳定表达Cas9 蛋白的DF-1 细胞具有不同水平的SSA 修复能力，表明本研究得到了稳定表达Cas9 蛋白且具有Cas9 核酸酶活性的DF-1 细胞系，可为后续在鸡细胞水平上进行功能基因筛选及鉴定等相关研究奠定基础。