番泻叶致小鼠急性腹泻模型的建立

蓝咫林，刘倩影，俞泳儿，陈淳，刘铮辉，徐军

（天津农学院 动物科学与医学学院，天津 300392）

腹泻是仔猪生产养殖过程中常见的疾病之一，也是小动物如犬猫临床中常见的消化道疾病。引起仔猪及犬猫腹泻的病因复杂多样，其中之一是断奶营养性腹泻，主要是因为仔猪消化系统及消化酶没有发育完全，肠道内的营养物质不能被及时消化吸收，存积于肠道内，形成渗透性腹泻。番泻叶腹泻模型是急性腹泻，也是分泌性腹泻，其腹泻机制是刺激肠黏膜而引起的电解质吸收受阻或分泌旺盛及肠蠕动频率过快[1-3]。关于番泻叶诱导腹泻的研究文献很多，但文献中番泻叶的用量、浓度、用药时长及试验动物各不相同[4-6]。本研究旨在用番泻叶诱导建立小鼠急性腹泻模型，通过观察、分析饲喂番泻叶后腹泻小鼠的血糖血脂变化、肠道变化、腹泻指数变化，对急性腹泻模型进行评价，为进一步研究断奶仔猪腹泻奠定前期试验基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

30只健康昆明雄性小白鼠，体重20 g左右。

1.2 药物

番泻叶（太极集团四川绵阳制药有限公司）100 g，加水熬制30 min，制成1 g/mL番泻叶水煎液。葡萄糖测定试剂盒和甘油三酯测定试剂盒均购于中生北控生物科技股份有限公司。

1.3 番泻叶致小鼠急性腹泻模型制备

30只昆明小鼠，随机分为3组，分别为空白对照组、试验1组和试验2组，每只每次分别灌服生理盐水0.2 mL、番泻叶水煎液0.2 mL、番泻叶水煎液0.3 mL。各组每天各处理2次。连续处理5 d，停药后观察2 d。

1.4 样本采集

记录每组小鼠日采食量和体重。记录小鼠精神状态和腹泻情况。第5 d灌胃后，小鼠分笼放置，笼底铺上定性滤纸，观察每只小鼠的腹泻次数及总便数，记录稀便污染滤纸的直径。分为4个等级。每个小时换一次滤纸，连续观察 5 h。稀便率＝稀便数/总便数，平均稀便级＝所有稀便级数/稀便次数[7]。

采样前断食不断水12 h。给药后第6天，每组随机抽取5只小鼠毛细管眼眶采血，3 500 r/min离心制备血清；于-20 ℃冰箱冻存。随即处死采血小鼠，采集小鼠距回盲口1 cm处的回肠1 cm、盲肠（生理盐水冲洗内容物），置于 4%甲醛溶液中固定保存。

1.5 检测指标

自动生化分析仪测定血清中葡萄糖和甘油三酯浓度；小鼠腹泻指数＝稀便率×平均稀便级；制作回肠、盲肠的苏木精－伊红（HE）染色病理切片。

1.6 数据处理

采用 SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，组间多重比较采用Duncan氏方法，结果表示为平均值±标准差。

2 结果

2.1 不同用量番泻叶对小鼠腹泻的影响

从表1可以看出，两个模型组的稀便率、稀便级、腹泻指数与对照组比较均差异显著（P＜0.05），两个模型组之间稀便率与稀便级差异不显著（P＞0.05），而两个模型组之间的腹泻指数差异极显著（P＜0.01）。说明番泻叶对小鼠造成了明显的腹泻影响。

表1 不同浓度番泻叶对小鼠腹泻的影响

2.2 不同用量番泻叶对小鼠体重的影响

从表2可以看出，小鼠初始体重无差异，给药造模后，模型组和对照组比较差异极显著（P＜0.01），模型组之间比较差异不显著（P＞0.05）。停药后模型组体重仍然增长缓慢，两组间比较差异不显著（P＞0.05），与对照组比较差异极显著（P＜0.01）。

2.3 不同用量番泻叶对小鼠血清指标的影响

从表3可以看出，血糖值各组之间差异不显著（P＞0.05）。模型组 1与对照组的甘油三酯差异不显著（P＞0.05）。模型组 2与模型组1及对照组甘油三酯差异极显著（P＜0.01）。

2.4 不同浓度番泻叶对小鼠临床表态的影响

对照组小鼠活泼好动，食欲好，粪便为表面光滑的长粒或圆粒状。模型组小鼠，给药一天后，即出现稀便，肛门周围有粪便污染。毛色无光泽，不喜动。模型组小鼠饮水增加，食欲不如对照组，体重不增反而降低。给药5 d后，停药两天期间，模型组小鼠腹泻缓解，便数仍比对照组多，稀便少，软便多。2个模型组小鼠体重较用药第5天均有所增加，提示番泻叶诱导小鼠腹泻有潜在自愈倾向。

2.5 不同用量番泻叶对小鼠肠道病理切片的影响

图1显示，对照组和模型组肠组织结构紧密，可见黏膜层、肌层及浆膜层，黏膜层肠腺丰富，绒毛上皮完整，细胞形态正常，组织未见明显坏死或炎症反应。图2显示，模型组2黏膜下层间隙增宽，肌层肌纤维排列疏松，着色变浅，绒毛上皮细胞少量脱落，未见明显坏死或炎症反应。

图1 不同浓度番泻叶对小鼠回肠黏膜的影响（HE×400）

图2 不同浓度番泻叶对小鼠盲肠黏膜的影响（HE×400）

3 结果分析

3.1 番泻叶急性腹泻模型评定

番泻叶主要化学成分是番泻总苷类，在大肠进一步分解，影响大肠尤其是结肠对水吸收，使肠腔容积增大，刺激肠壁反射性加剧小肠和结肠蠕动，促进肠黏膜释放前列腺素，在保护肠黏膜的同时，炎性介质致使肠细胞通透性增加，最终导致腹泻[3，8]。研究表明，验证腹泻模型可通过观察小鼠粪便情况进行。粪便呈湿便、泻下清水、便溏、黏液便都属于腹泻发生。而腹泻症状、体征表现及腹泻指数是评价腹泻的标志性指标[3]。黄嘉璐用1 g/mL番泻叶水煎液每天1次0.4 mL/20 g灌胃小鼠，连续作用7 d，喜杰等用0.5 g/mL番泻叶水煎液0.02 mL/（g·d）连续给药大鼠7 d，均得试验腹泻模型[9-10]。而苏萍等灌服0.2/mL番泻叶0.5 mL/只，连续5 d，也得腹泻模型[11]。本试验使用相同浓度的番泻叶，分别每只0.2 mL和0.3 mL灌胃小鼠相同浓度不同数量的番泻叶，每天1次制作小鼠急性腹泻模型。作用5 d后，症状、体征和腹泻指数变化明显。试验期间无死亡现象发生。根据文献报道可认定小鼠急性腹泻模型成立[3-4]。本试验停药2 d后，两个模型组小鼠体重较用药最后一天有缓慢增加。提示，本研究1 g/mL番泻叶分别0.2、0.3 mL灌服小鼠，连续作用5 d，停药后小鼠急性腹泻模型有退化的可能。这与赵妍等的研究，0.2 g/mL番泻叶＋束缚1 h和0.2 g/mL番泻叶＋束缚1.5 h作用的大鼠，体重在7 d后均有不同程度增加[12]有相似之处。而赵妍等研究发现0.3 g/mL番泻叶＋束缚1 h番泻叶作用的大鼠在14 d的试验过程中体重一直在下降[12]。说明番泻叶致小鼠腹泻模型的稳定性与番泻叶的浓度和剂量有密切关联。

3.2 番泻叶对小鼠回肠及盲肠黏膜结构影响

王杨等研究发现灌胃番泻叶水煎液（20 mL/kg），给药2周。大鼠排水样稀便，小肠绒毛表皮细胞明显凋亡与坏死，固有层毛细血管扩张充血明显，间质有少量中性粒细胞浸润[13]。赵妍等研究发现番泻叶＋束缚致大鼠腹泻，14 d时各组肠道黏膜层、黏膜下层和肌层结构完整，未见有病理学改变[12]。本研究各组回肠及结肠虽黏膜下层间隙增宽，肌纤维排列松弛，绒毛上皮细胞少量脱落，但均未见明显坏死和炎症反应。这可能是因为番泻叶能促进肠黏膜释放一定量的前列腺素，保护了肠黏膜[8]。同时说明本研究所致小鼠腹泻并不严重，未引起肠道黏膜组织形态学上明显变化，也说明腹泻模型腹泻程度和所用番泻叶浓度、剂量及作用天数有关联。

3.3 番泻叶对小鼠生化指标影响

从试验的生化指标来看，腹泻对血糖没有明显影响，而模型组1与对照组的甘油三酯差异显著，模型组2与模型组1及对照组的甘油三酯差异极显著（P＜0.01）。说明腹泻会影响小鼠甘油三酯的血液水平，并且随着番泻叶用量增加，腹泻指数增加，甘油三酯血液水平明显下降。黄嘉璐通过非靶向代谢组学对尿液血清代谢物分析发现，番泻叶致泻过程可以导致机体氨基酸代谢紊乱，三羧酸循环失调、多巴胺降解紊乱，产生一系列炎症物质包括前列腺素[9]。姚万玲通过构建大鼠大肠湿热证模型，使用代谢组学分析方法，发现治疗药物可以通过作用在脂肪分解、脂肪酸氧化分解的代谢通路来缓解腹泻[14]。以上文献均表明腹泻会影响体内糖、脂类及氨基酸代谢。由此推测本研究结果番泻叶腹泻导致体重下降，是因为机体为了维持血糖水平恒定，使脂肪分解加快，肌肉分解加快，糖异生原料增加，糖异生加快，从而消耗了血液中的脂类，导致造模期间小鼠体重下降[15]。