绣球菌冻干片对S180 荷瘤小鼠抗肿瘤作用

徐媛媛，陈 萌，徐晓飞

（广东海洋大学食品科学与工程学院，广东 阳江 529500)

食用菌有悠久的食用和药用历史，因其富含纤维、多种营养素、美味和低热量而广受欢迎，许多体外和动物研究报告了食用菌的保健作用，如免疫调节、抗氧化等[1]。绣球菌是近年来人工培育成功的一种新兴食用菌，子实体呈白色或淡黄色，外形似绣球，又名为花椰菜菇，野生资源非常稀少，是名贵食药用菌[2]，在生物学分类上隶属绣球菌科（Sparassisidaceae）绣球菌属（Sparassis）[3]。研究发现，绣球菌中含有高比例高分子多糖、氨基酸和丰富的矿物质和维生素[4]，此外还有多酚类、黄酮类、萜类、生物碱、邻苯二甲酸酯等活性成分[5]，特别是β-(1,3)-葡聚糖的含量非常丰富。日本食品分析化验所测得β-(1,3)-葡聚糖含量为43.5 g/100 g干重[2]；我国学者报道绣球菌柄部和瓣片部分的含量分别为54%和56%，极显著高于猴头菇、香菇、蛹虫草和草原黄蘑菇[6]，为已知食用菌之最。因此，对食用菌进行深加工有利于开发食用菌资源，发挥其活性成分丰富的优势[7]。

近年来，我国肿瘤患者数量持续增长，给社会医疗系统带来巨大负担[8]。机体免疫功能特性与状态在肿瘤的发生、发展以及转移过程中具有重要的作用[9]。因此，增强肿瘤病人的免疫功能成为提高抗肿瘤治疗效果的一个重要手段。在众多具有激活机体免疫系统、提高免疫功能的天然活性物质中，β-(1,3)-葡聚糖具有来源广泛、活性强、耐受性好、副作用小等特点[10]，已经有超过10 000 项在同行评审期刊上发表的科学研究[11]，也是众多临床试验的对象[12]。绣球菌是β-(1,3)-葡聚糖的良好来源，日本学者用绣球菌粉喂食接种S180 肿瘤细胞的小鼠5 周后，发现肿瘤重量明显比对照组小，且小鼠生存时间延长[13]，提示绣球菌可应用于辅助抑制肿瘤食品。在前期研究中，通过将绣球菌子实体粉碎结合微压提取方式，开发了一种绣球菌深加工标准化原料，并取得了食品原料标准备案[广东省食品安全企业标准《绣球菌浓缩液》（Q/WQYS 0083 S—2022），备案号：44020005S-2023][14]。为方便加工使用，进一步将浓缩液冻干制得冻干片[广东省食品安全企业标准《绣球菌冻干片（压片糖果）》（Q/WQYS 0088 S—2023），备案号：44020023S-2023]。本试验通过建立S180 荷瘤小鼠模型，探究绣球菌冻干片对S180 肿瘤的抑制作用，检测小鼠细胞免疫和体液免疫功能指标变化，分析肠道中短链脂肪酸（Short Chain Fatty Acids，SCFAs）水平，旨在为绣球菌冻干片的抗肿瘤作用及机理提供试验证据，也为食用菌深加工方向提供一种参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

4～8 周龄BALB/C 小鼠，雄性SPF 级100 只购自广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2022－0002，实验动物质量合格证号№440072001202044。动物实验环境：广东省中医药工程技术研究院SPF 级动物实验室，设施使用许可证号：SYXK（粤）2020-0059。试验伦理由广东省第二中医院试验动物伦理委员会批准（049176）。

1.2 材料与试剂

绣球菌冻干片（0.5 g/片×3片/袋，每100 g含β-1,3-葡聚糖10.7 g），批号：20230501，本研究团队研发并由上海雪榕源生物有限公司制造，推荐服用量1.5 g·d-1。破壁灵芝孢子粉胶囊（0.3 g/粒×60粒，每100 g含多糖1 g，总三萜3 g），批号：2301091P142，广州白云山汉方现代药业有限公司，推荐服用量1.8 g·d-1。茯苓多糖口服液（每100 mL 含茯苓多糖1.6 g），批号：20230601，湖南补天药业股份有限公司，临床治疗推荐服用量30 mL·d-1。乙酸（纯度99.8%）、丙酸（纯度99.5%）、异丁酸（纯度99.5%）、丁酸（纯度99.5%）、异戊酸（纯度99%）、戊酸（纯度99%），上海麦克林公司。

S180 细胞、L929 细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司；1640 培养基，上海中乔新舟生物科技有限公司；胎牛血清，维森特生物技术（南京）有限公司产品；CCK-8 试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；刀豆凝集素ConA，西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；小鼠白细胞介素2（IL-2）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素8（IL-8）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA 试剂盒，江苏酶免实业有限公司。

1.3 仪器与设备

小型高速离心机（5450 型），德国Eppendorf 公司；电子天平（BSA2245 型），赛多利斯科学仪器有限公司；Varsoskan Flash 多功能酶标仪，美国Thermo 公司；倒置显微镜（DMi1 型），Leica 公司；GC-2010PLUS气相色谱仪，岛津仪器公司；DB-FATWAX 毛细管色谱柱，安捷伦仪器公司。

1.4 试验方法

1.4.1 S180 细胞培养

S180 细胞复苏后用含10%胎牛血清的培养基于5%CO2、37 ℃培养箱中培养，染色鉴定活细胞数≥95%，随后用培养液调整至106个/mL 浓度。

1.4.2 S180 荷瘤小鼠模型建立与试验分组

取50 只小鼠腹腔注射S180 细胞，接种7 d 后，在无菌条件下取荷瘤小鼠的腹水与生理盐水按1 ∶3 的比例稀释至2×107～3×107个/mL 浓度。然后对剩余50 只小鼠右腋皮下注射0.2 mL 腹水稀释液，建立S180 荷瘤小鼠模型[15]，随后按表1 将小鼠随机分为5 组，每组10 只。本实验以造模当天记为第“0 d”，造模次日，口服灌胃给药体积0.2 mL，1 次/天，持续18 d。

表1 S180 荷瘤小鼠分组与灌胃剂量设计表

1.4.3 荷瘤小鼠体质量、瘤体质量、瘤体指数和体积测定

每天观察并记录小鼠的活动情况，在第2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d、14 d、16 d、18 d 测定小鼠的体重。给药18 d 后断颈处死小鼠，剖取肿瘤测定瘤重，按式（1）计算瘤体指数。

式中：m1为肿瘤质量，mg；m2为小鼠体重，g。

用游标卡尺测量肿瘤尺寸并按式（2）计算瘤体体积。

式中：D为肿瘤最大直径，cm，d为肿瘤最小直径，cm[16]。

1.4.4 肿瘤抑制率的测定

根据式（3）计算各样品的肿瘤抑制率。

式中：M为模型组瘤重与小鼠体重的比值；N为试验组瘤重与小鼠体重的比值[15]。

1.4.5 白细胞计数、细胞因子和脏器指数的测定

结束实验后，小鼠麻醉后进行眼眶采血，测定白细胞数量；4 ℃、3 000 r·min-1离心l0 min 收集血清，按ELISA 试剂盒操作方法分别测定小鼠血清中IL-2、IL-6、IL-8 和TNF-α 水平。无菌剖取小鼠胸腺、脾脏，准确称重并计算胸腺/脾脏指数：脏器指数=脏器重量（mg）/小鼠体重（g）。

1.4.6 脾淋巴细胞增殖活性和脾NK 细胞杀伤活性测定

按照文献制备脾细胞悬液[17]，用含10%胎牛血清的RPMI1640 培养液调整细胞数为2×106/mL 后，将细胞悬液加入细胞培养板（0.2 mL/孔），加7.5 μg·mL-1ConA（0.01 mL/孔），以未加ConA孔作对照孔，5%CO2、37 ℃饱和湿度下培养24 h，于培养结束前1 h 左右，每孔吸弃100 μL 培养液上清后加入CCK-8（0.01 mL/孔），并设RPMI1640培养液空白对照，各处理均采用3个复孔。用酶标仪450 nm 波长测定每孔OD值。脾淋巴细胞增殖活性=（刺激孔OD值/对照孔OD值）×100%。

同上法制备脾细胞悬液，按文献报道方法测定脾NK 细胞杀伤活性[18]。

1.4.7 小鼠结肠内容物中短链脂肪酸SCFAs 的测定

无菌剖取小鼠肠组织，于冰上切开肠组织，无菌PE管收集每只小鼠结肠内容物，标记后速冻、-80 ℃保存。按照文献方法检测内容物中6 种短链脂肪酸的浓度[19]。

1.5 统计方法

所有计量资料以平均数加减标准差（x-±s）表示。多组间均数比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），相关性分析采用Pearson，由SPSS22.0 软件完成，P＜0.05 代表有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 试验样品对小鼠体重的影响

如图1 所示，给药前各组小鼠体重无明显差异（P＞0.05）；试验过程中，荷瘤模型组小鼠体重呈现先上升后下降的趋势，GS 和PCP 组体重变化趋势与模型组相似（16 d 前）；SCL 和SCH 组体重开始增长缓慢然后明显增加，16 d 后，SCL 和SCH 组小鼠体重均比GS 和PCP 组高。

图1 试验期间各组小鼠平均体重的变化图

2.2 试验样品对小鼠存活率和肿瘤生长的影响

试验结束后，Model、GS、PCP、SCL 和SCH 组分别有4 只、2 只、1 只、2 只和2 只小鼠死亡，各组存活率和对肿瘤抑瘤作用见表2。各试验样品均对S180肿瘤生长有一定抑制作用；从瘤体指数分析，与模型组相比，各试验样品均对S180 瘤体指数有极显著的影响，GS 组和SCH 组的抑制效果相当，PCP 组和SCL组的抑制效果相当；从瘤体体积来看，PCP 组和SCL组的抑制效果相当。SCL 组与SCH 组结果反映了绣球菌冻干片对肿瘤抑制作用具有剂量依赖性，高剂量优于低剂量。

表2 荷瘤小鼠存活率和试验样品对肿瘤抑制作用表

2.3 试验样品对荷瘤小鼠免疫功能的影响

2.3.1 脏器指数

白细胞是机体外周血中各种免疫细胞的统称，包括T 细胞、NK 细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B 细胞等。免疫器官脏器指数一定程度反映了整体免疫功能强弱。由图2 可知，各样品对荷瘤小鼠的白细胞数量无显著影响，对脾脏指数有一定提高作用，其中SCH 组显著高于Model 组和PCP 组，说明高剂量绣球菌冻干片能明显提高脾脏指数；各样品均能极显著提高荷瘤小鼠的胸腺指数，但各试验组间无统计学差异。

图2 试验样品对荷瘤小鼠白细胞计数和脏器指数的影响图

2.3.2 细胞因子水平

细胞因子水平反映了体液免疫功能的变化，对荷瘤小鼠外周血细胞因子水平的影响见图3。在IL-2 水平上，PCP、SCL 和SCH 组显著高于Model 组，然而各样品对IL-6 和IL-8 作用不明显，但可以显著或极显著提升TNF-α 水平，其中SCH 组提升程度最大。综上所述，灵芝孢子粉、茯苓多糖和绣球菌冻干片能够提高荷瘤小鼠IL-2 和TNF-α 水平。

图3 试验样品对荷瘤小鼠细胞因子水平的影响图

2.3.3 细胞活性指标

脾淋巴细胞增殖活性和脾NK 细胞杀伤活性反映了机体细胞免疫功能。由图4 可知，相比模型组，GS 组脾淋巴细胞增殖活性有提升但无统计学意义，而PCP、SCL 和SCH 组显著增强（P＜0.01）；同时，各样品也显著提升了荷瘤小鼠的NK 细胞杀伤活性，其中以SCH 组提升程度最高。

图4 对荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖和NK 细胞杀伤活性的影响图

综合脏器指数、细胞因子水平和细胞活性指标，灵芝孢子粉、茯苓多糖和绣球菌冻干片均具有提高荷瘤小鼠体液免疫和细胞免疫功能的作用。绣球菌冻干片对荷瘤小鼠的免疫增强作用存在剂量依赖性，以高剂量绣球菌冻干片的效果为好。

2.4 试验样品对肠道SCFAs 浓度的影响

为考察试验样品对肠道菌群代谢的影响，采用GC-MS 检测了小鼠结肠内容物中6 种SCFAs（乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸和正戊酸）的浓度。Model、GS 和PCP 组各有一只小鼠的结肠内容物中未检测出SCFAs，绣球菌冻干片高低剂量组小鼠均可检出，数据结果如图5 所示。与模型组相比，各样品组小鼠的6 种SCFAs 浓度有增加的趋势但无统计学差异，总SCFAs 浓度也呈现类似的结果，其中绣球菌冻干片SCL 和SCH 组 总SCFAs 分别为（3.40±0.24）mg·g-1和（3.42±0.12）mg·g-1，提示绣球菌冻干片的剂量对SCFAs 的浓度无明显影响。

图5 试验样品对荷瘤小鼠结肠内SCFAs 浓度的影响图

2.5 免疫功能指标与抑制肿瘤作用的相关性

为探索免疫指标与肿瘤抑制效果的关系，利用Pearson 进行相关性分析，如图6 所示，瘤体指数与IL-2、TNF-α 水平的Pearson 相关系数（R）分别为-0.538 和-0.536（P＜0.01），表明瘤体指数与两种细胞因子浓度具有中等程度的负相关性。

图6 免疫功能指标与瘤体指数的相关性图

3 讨论

灵芝是我国传统的食药两用真菌，孢子是灵芝的生殖细胞。三萜类化合物和多糖是灵芝孢子粉的主要活性成分[20]，众多研究表明灵芝孢子粉可以通过促进淋巴细胞的增殖、增强巨噬细胞功能、促进NK 细胞活性和提高细胞因子分泌，以及调控程序性细胞死亡蛋白1 表达和调节肠道菌群平衡，从而发挥免疫调节活性，实现增强机体免疫功能和抗肿瘤作用[21]。茯苓多糖占茯苓菌核重量的70%～90%，体内外实验证明茯苓多糖通过调节细胞免疫和体液免疫功能、诱导细胞凋亡、抑制侵袭转移发挥抗肿瘤作用[22-23]。绣球菌中富含β-1,3-葡聚糖[2]，从绣球菌中分离得到的β-1,3-葡聚糖在20～500 mg·kg-1剂量范围注射S180荷瘤小鼠，可在小鼠体内抑制肿瘤的生长并呈现量效关系[24]；从绣球菌中提取获得的多糖，通过破坏细胞膜的完整性抑制人类结肠癌细胞系Caco-2、LS180 和HT-29 的增殖，表现出抗结肠癌的潜力[25]；绣球菌多糖也可诱导白血病细胞K562、THP-1 细胞的凋亡[26]。此外，绣球菌多糖能提高免疫低下小鼠的脾脏指数，增加白细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和单核细胞及血小板数量，增强T 淋巴细胞增殖能力，促进脾免疫细胞分泌IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B、穿孔素和IL-2，抑制IL-10 的分泌，证明绣球菌多糖可提高免疫低下小鼠细胞免疫和体液免疫功能[27]。由此可见，绣球菌冻干片的抗肿瘤作用与绣球菌多糖的增强免疫功能、抗肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡密切相关。同时，绣球菌中除多糖类成分外，还有其他成分如蛋白质和多酚类成分[5]。食用菌中蛋白质和多酚成分也具有免疫调节作用，同时不同成分之间也可能存在协同作用[28]。然而，有关绣球菌中蛋白质和多酚的免疫调节作用和机理暂无报道，有待未来的进一步研究。

本研究中，Pearson 相关性分析发现肿瘤指数与IL-2、TNF-α 浓度呈负相关。IL-2 是T 淋巴细胞和NK 细胞增殖和分化的刺激因子[29]，IL-2 可调节CD4+T 细胞分化和功能，也调控与癌症免疫治疗有关的CD8+T 细胞的杀伤效应和记忆反应[30]，CD8+T 细胞主要是细胞毒性T 淋巴细胞，具有杀伤包括被病原体感染的体细胞和肿瘤细胞的作用。TNF-α 主要由激活的巨噬细胞产生，TNF-α 通过与肿瘤细胞表面肿瘤坏死因子受体1（Tumor Necrosis Factor Receptor 1，NFR1）或TNFR2 结合，激活与细胞凋亡相关核转录因子NF-κB 和丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）信号通路，发挥抗肿瘤作用[31]。众多研究表明β-葡聚糖可激活中性粒细胞、巨噬细胞、NK 细胞和树突细胞，刺激细胞因子包括白介素IL-2 和TNF-α 的分泌，诱导细胞凋亡和阻断血管生成等多途径发挥抗肿瘤作用[32]。本试验中，试验样品增加了荷瘤小鼠细胞因子IL-2 和TNF-α 浓度，有助于提升抗肿瘤效果，与前人研究结果相符。

SCFAs 是肠道菌群的代谢物之一，具有调节宿主免疫细胞发育、分化和免疫系统功能的作用[33]。众多研究表明，食用菌多糖可以调节肠道菌群组成和促进SCFAs 的产生[34]。在本研究中，灌胃茯苓多糖、绣球菌多糖对结肠部位6 种SCFAs 和总SCFAs 浓度无明显影响，表明试验样品对荷瘤小鼠免疫功能的调节作用可能是通过非SCFAs 依赖途径来实现。在小肠部位，由肠上皮细胞、固有层免疫细胞和派氏结等组成肠黏膜免疫系统是识别和响应外来抗原物质的主要系统[35]，多糖可以通过免疫受体介导与黏膜免疫系统作用而调节整体免疫系统功能[36]，由此说明，食用菌多糖可以通过多种途径实现免疫调节作用。

4 结论

本文采用S180 荷瘤小鼠模型评价绣球菌冻干片的抗肿瘤潜力和小鼠免疫功能指标的变化，推测绣球菌冻干片可能是通过提高荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数，促进细胞因子IL-2 和TNF-α 分泌，增强脾淋巴细胞增殖能力和NK 细胞杀伤活性来抑制S180肿瘤生长并提高荷瘤小鼠生存率。本研究结果可以为绣球菌应用于提高免疫功能相关的功能食品开发提供参考。