酶联免疫吸附试验操作中的注意事项

邹子云 光泽县动物疫病预防控制中心 福建光泽 354100

ELISA 是兽医实验室中最普遍使用的试验种类之一，具有良好的准确性和灵敏性，操作步骤简单，不易产生试验环境污染。 因此，被广泛用于猪瘟、口蹄疫、 小反刍兽疫和猪繁殖与呼吸综合征抗体实验室检测项目中。 根据日常操作和试验步骤中细节问题的处理， 总结分析ELISA 试验中常见的细节问题，以减少试验过程中由主观因素造成的误差，从而提高试验的准确性。

1 试验前准备注意事项

1.1 样品 样品在采集、制备、保存过程中，要注意以下几点。 首先，采集的每份样品应保证之后试验、复检、留样的使用数量；其次，采集完的样品竖直向上摆放，避免剧烈震荡，如果出现严重溶血现象，后期难以清洗干净，容易出现假阳性；最后，样品保存时不能反复冻融，2～8 ℃保存3 d，-20 ℃可长期保存。 此外，使用前须将样品轻柔地上下颠倒混匀，保证离心管中各个位置抗体浓度一致， 不可剧烈晃动混匀。

1.2 试剂盒 试剂盒在使用前需平衡至室温 （20～25 ℃），若放置于实验室中自然回温，耗时较长且各组件回温程度不均匀。 建议将试剂盒各组件放在恒温箱中回温，包括配制洗涤液使用的纯净水。恒温箱温度设定在25 ℃，内部放置温度计，确保箱内温度能准确达到25 ℃，每一步使用时将所要用到的试剂组件取出。 不同批次的试剂不可混合使用。 试剂盒严格按照要求保存， 放在冰箱中应避免靠在冰箱内壁上，以免造成结冰。未使用完的反应板要保存在放有干燥剂的密封袋内。

2 试验操作过程注意事项

2.1 加样 在加入第一个样品与最后一个样品之间存在时间差，因此，每个样品与孔板接触和反应的时间就存在细微差异。 为保证每个孔的反应时间大致一样，在加样过程中要把握移液枪的熟练使用，每次加样都要匀速准确。 此外，在加入不同试剂时，都要选择相同的方向和顺序， 如果一开始加入样品是从左往右，那么之后每一步都应该从左往右，中途不能更换， 这样可以有效减小和抵消反应时间差带来的不利影响。

2.2 孵育 目前使用的试剂盒通常有25 ℃室温孵育和37 ℃恒温箱孵育两种方式。 室温孵育时，温度控制在20～25 ℃，反应板应避免放置在阳光直射、冷热风出口、潮湿桌面等温度不均匀的地方。恒温箱孵育时，反应板由25 ℃升至37 ℃需要时间，因此，可以推迟几分钟开始计时。 孵育开始前要用封膜盖紧反应板，避免液体蒸发。撕开封膜时要紧紧按住反应板中部， 否则反应板容易被黏性封膜带起后砸落在桌面上，造成液体飞溅。 多个反应板不能叠加摆放，以免受热不均。

2.3 洗版 洗涤液要按照试剂盒说明书的要求按比例稀释。 稀释之前应该注意浓缩液中是否有结晶沉淀，如果有，就需要让浓缩液继续回温直至没有结晶沉淀才能进行下一步稀释。 通常使用多道移液器添加洗涤液，在吸取洗涤液时，应稍微留意每个吸头的液面是否一样，而在打入洗涤液时，要避免太过用力，推力过大会导致洗涤液飞溅。吸水纸应当选择干净、 无尘、 吸水效果好的材料。 目前， 试验使用的ELISA 反应板通常都是可拆卸的，而在弃去废液时，容易造成反应板脱落、 掉入废液池中， 导致试验失败。 因此，建议在试验开始前，可用白色胶带固定反应板四周，一是方便标记横竖序号，二是可以固定反应板，避免松动、脱落。

2.4 显色 显色反应是试验的最后一个反应步骤，酶催化反应产生有色物质，阴性不变，而阳性会随着反应时间延长而颜色加深。因此，影响因素除了之前的温度和时间外，还有光照。 在加入反应底物后，可将反应板装在深色纸袋中， 按说明书要求的温度放入恒温箱或置于室温环境。 加入终止液，温和震荡，让液体充分混合、终止反应，注意不要洒出，并尽快读数。 在使用前要查看反应底物和终止液是否无色透明，如果出现变色则不能使用。

2.5 读数 读数开始前，用干净的纸巾轻轻擦拭反应板底部，去除底部吸附的杂质和液体，避免影响反应板的透光度。按照说明书要求调整好波长，酶标仪在使用前半小时打开预热，以提高读数的准确性。

2.6 其他 本地区除夏季外，其他季节早晚温差较大，尤其是秋季集中监测，通常在11 月底至12 月初进行试验。早晨时试验环境温度较低，回温时间应当加长。 值得注意的是，当环境温度达到试验要求时，试验工作台台面依然温度过低， 用红外测温仪测量发现二者间温差达6～7 ℃。因此，可以在台面与反应板之间放置一块泡沫板， 从而减少温度差异产生的不利影响。

3 总 结

ELISA 试验简单易懂， 但是每个步骤都有可能影响试验结果的准确性，从开始的样品、试剂准备到最后的显色、读数都有可能产生误差。 因此，精密的仪器、 良好的检测试剂以及准确无误的操作都是试验是否准确的组成部分。作为试验人员，所能把握的便是操作严格按照说明书要求进行， 尤其是对细节的把控，是试验结果真实、准确的保障。