豆芽发芽过程中黄酮类成分的检测及变化研究

贾寒冰，王苑桃，何亚琴，孙晓，刘皖臻，李旸

西安市食品药品检验所（西安 710054）

大豆异黄酮是一类具有重要生物活性的化合物，在大豆及其制品中含量丰富，作为一种次级代谢产物，伴随大豆的生长形成[1-2]。大豆异黄酮具有抗氧化作用，同时具有抗癌作用，作为一种类雌激素，大豆异黄酮具有改善妇女更年期综合征、预防心血管疾病等生物活性和药理活性[3]。自然界中异黄酮的资源有限，大豆作为重要的粮食作物，其大豆异黄酮含量在营养学上有重要意义[4]。

虽然大豆保健功效好，营养价值高，但大豆同时含有植物凝集素、单宁、胰蛋白酶抑制因子、植酸[5-6]等，还有棉籽糖、水苏等寡糖无法被吸收，影响人体对大豆中其他营养素的吸收。将豆子泡发成豆芽后，大分子化合物分解成更易被消化吸收的小分子物质[7]，豆腥味被降解[8]，大豆的适口性、营养性和安全性得到改善；大豆中的生物活性物质如维生素、皂苷、多肽、多酚类、大豆异黄酮和γ-氨基丁酸等含量增加[9]，加之发芽可使抗胰蛋白酶抑制剂含量降低，亦可使抗营养素如半乳糖苷、植酸等的含量降低[10]，使大豆的营养价值和保健作用均提高。有研究表明，发芽的大豆，即黄豆芽，含有多种营养素，和其他生物活性化合物一起，为人体健康提供良好物质来源[11]。

已有研究报道豆芽中的大豆异黄酮物质变化[12-13]，但大多数都是以染料木素为大豆异黄酮的代表[14]，而忽略豆芽中大豆异黄酮含量中重要的葡萄糖型大豆异黄酮种类，即大豆苷、大豆黄苷、染料木苷的含量变化，因此黄豆发芽过程中6种异黄酮含量变化几乎为空白。试验旨在建立豆芽中6种大豆异黄酮类物质，即大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素的检验方法，并检测不同发芽时间的豆芽中这6种大豆异黄酮含量及其变化，可为豆制品中异黄酮类物质检测提供方法，为评价黄豆芽所含功能性成分、更好确定黄豆芽的最佳食用时间等提供基础研究数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素混合标准品（纯度98.2%~99.8%，天津阿尔塔公司）；甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；二甲亚砜（分析纯，国药化学试剂有限公司）实验室用水（Milli-Q超纯水）。

1.2 仪器与设备

Thermo Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国Thermo公司）；ME204电子天平（瑞士Mettler公司）；KQ-700VDB型超声波振荡器（昆山市超声仪器有限公司）；HC-3018R高速离心机（安徽中佳科学仪器有限公司）；pH计（瑞士Mettler公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

挑选颗粒饱满、大小均匀，无残缺、虫蛀的市售黄豆，用自来水清洗掉表面杂质和灰尘，5倍水（W/V）浸泡24 h，浸泡后的大豆用自来水洗3遍，放入底部铺2层纱布的器皿中，表面用2层纱布覆盖，置于25 ℃恒温培养箱，发芽过程注意避光，每12 h用50 mL蒸馏水淋洗1次。定时取出豆芽放在40 ℃烘箱中烘干10 h。分别取干燥好的浸泡后的豆芽及发芽24，48，72和96 h的豆芽，用粉碎机粉碎，装入清洁容器种并标注好时间，放入-18 ℃的冰箱中保存备用。

1.3.2 标准储备液配制

取大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素混合标准品1.0 mL，用二甲亚砜溶液定容到10 mL，制成6种异黄酮类混合标准储备液，4 ℃避光保存。中间液用80%甲醇水溶液逐级稀释，配制成1，2，5，8，10和20 μg/mL的混合标准使用液，用于绘制标准标曲，定量方式为外标法。

1.3.3 样品前处理

准确称取5.0 g样品，置于规格50 mL的容量瓶中，加入甲醇︰水=8︰2（体积比）的溶液到接近刻度线的位置，超声波提取20 min，用同样的溶液定容后，摇匀。将样品溶液放置于离心管中，以8 000 r/min离心3 min，取上清液经0.45 μm有机滤膜滤过后，上机待测。

1.3.4 色谱条件

色谱柱DIKMA Diamonsil Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长260 nm，流动相A为乙腈，B为磷酸水溶液（pH 3）。梯度洗脱程序为：0~20 min，12%~30% A；20~32 min，30% A；32~36 min，30%~80% A；36~37 min，80%~12% A；37~45 min，12% A。

1.3.5 定性、定量检测

1.3.5.1 定性检测

取1.3.2中10 μg/mL混合标准使用液和按1.3.3处理所得样品溶液进行上机测定，根据6种异黄酮各组分在色谱柱中的行为差异，体现在色谱图中为不同保留时间，以此定性。

1.3.5.2 定量检测

将不同浓度的6种异黄酮混合标准品上机检测，纵坐标为各异黄酮的色谱峰面积，横坐标为各异黄酮的具体浓度，绘制曲线，曲线浓度尽可能覆盖样品中各组分的浓度，如果样品浓度超出曲线范围，则将样品溶液适当稀释。

2 结果与分析

2.1 样品提取条件的优化

2.1.1 提取试剂的优化

分别用甲醇溶液、80%甲醇溶液、乙腈溶液、80%乙腈溶液、二甲亚砜溶液、50%二甲亚砜溶液提取，结果表明，采用80%甲醇溶液的提取率最高，提取效果最好。

2.1.2 提取方式的优化

比较振荡、超声、磁力搅拌等3种提取方式的提取效果。由于豆芽粉碎后会聚在一起，磁力搅拌效果并不好；振荡对于离心管的要求比较高，稍不留意溶液就会洒到离心管外壁上，影响提取的效率，超声提取可以避免另外2种提取方式带来的弊端，因次选用超声20 min的提取方式。

2.2 色谱条件的优化

6种异黄酮极性不同，故采用梯度洗脱的方式进行分离，为得到更好的分离效果，采用不同的流动相进行分离。试验用乙腈-水、甲醇-水作流动相时，大豆苷和大豆黄苷不能完全分离；用色谱甲醇和含0.1%甲酸的水溶液作流动相时，大豆黄素和大豆素分离效果不理想；采用磷酸水和乙腈，通过优化磷酸的pH和比例，使6种标样混标得到很好分离，详见图1。豆芽发芽过程中提取液也可得到有效分离，详见图2。

图1 6种大豆异黄酮标准溶液色谱图

图2 发芽96 h豆芽中6种大豆异黄酮色谱图

2.3 方法的线性关系与检出限、定量限

将分别配制的1，2，5，8，10和20 μg/mL 6种不同浓度的标准液在上述色谱条件下进行测定，绘制标准工作曲线。以S/N=3确定方法的检出限，S/N=10确定方法的定量限。6种异黄酮类的标曲和检出限和定量限如表1所示。

表1 6种异黄酮的标准曲线方程与检出限

2.4 方法的回收率和精密度

由于豆芽中6种异黄酮组分含量差异较大，且均在1~100 mg/kg，试验所用标准品为6种异黄酮的混合标准品，故在优化试验条件下，分别对样品加入1倍、6倍和10倍定量限浓度的标准品后进行测定，平均回收率在90%~110%，SRSD在5%以内，符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》的要求，可以满足检测需求。

表2 6种异黄酮类的加标回收率及相对标准偏差（n=6）

2.5 豆芽中6种异黄酮类成分的变化

由图3可以看出：大豆在整个发芽过程中含量均有变化，大豆异黄酮的总量先增加后减少，且总量在发芽后48 h达到最大；其中大豆素、大豆黄素、染料木素的含量不断增加；不论在哪个阶段，大豆苷和染料木苷的含量之和占所有异黄酮种类之和的比重均在60%以上，因此，豆芽中的大豆异黄酮主要为大豆苷和染料木苷。

图3 大豆发芽过程中6种异黄酮含量变化

发芽过程中发现，72和96 h的豆芽出现纤维化现象。从浸泡后到发芽48 h，也就是出现纤维化现象前，6种异黄酮均不同程度增长，大豆苷增加60.0%，其中染料木苷增加63.3%。出现纤维化现象后，大豆苷、大豆黄苷、染料木苷的含量均有所降低，其中染料木苷含量降低50.7%，大豆黄苷含量降低49.6%，大豆苷含量降低9.97%。所以说纤维化是影响豆芽中异黄酮类物质含量的一个原因，在泡发豆芽时，要注意观察，不要泡发过长时间，以免豆芽出现纤维化现象。

分析原因，纤维化发生前，所有异黄酮类物质含量均有所增加，可能原因是大豆在发芽过程中，其呼吸作用逐渐增强，其内溶物发生一系列生化反应，酶的种类和数量增加，如苯丙氨酸氨基裂解酶（PAL）[15-17]，此酶是生物合成大豆异黄酮代谢的重要酶，该酶激活大豆异黄酮的合成体系和转化体系。大豆体内的内源性糖苷酶也可能发挥作用，使大豆异黄酮糖苷和苷元间发生转化[18-19]，从而使得异黄酮类物质量不断增加。

3 结论

试验建立大豆制品中的大豆苷、大豆素、大豆黄苷、大豆黄素、染料木苷、染料木素等6种异黄酮类的HPLC-DAD检测方法。结果表明，6种物质线性关系良好，加标回收结果符合要求，灵敏度高，前处理操作简便，可用于在实际检测工作。

豆芽中大豆异黄酮的主要种类为大豆苷和染料木苷，两者的含量之和占所测大豆异黄酮含量的60%以上；经过发芽可以提高豆芽中大豆异黄酮含量，但要防止豆芽纤维化，纤维化会使大豆苷、大豆黄苷、染料木苷的含量降低。