例析PCR技术在基因工程中的应用

盛文龙 郑 重

(浙江省余姚中学)

PCR是聚合酶链式反应的简称。它是一项根据DNA半保留复制的原理,在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件,对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。该技术具有简便、快速、灵敏等特点,虽然问世时间不长,但已成为分子生物学中强有力的工具之一,在许多新的领域都有应用。

1.获取和扩增目的基因

【例1】(2016年天津卷,第7题节选)人血清白蛋白(HSA)具有重要的医用价值,只能从血浆中制备。如图1是以基因工程技术获取重组HSA(rHSA)的两条途径。

图1

(1)为获取HSA基因,首先需采集人的血液,提取________合成总cDNA,然后以cDNA为模板,使用PCR技术扩增HSA基因。图2中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向,请用箭头在方框内标出另一条引物的位置及扩增方向。

图2

(2)启动子通常具有物种及组织特异性,构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体,需要选择的启动子是________(填写字母,单选)。

A.人血细胞启动子

B.水稻胚乳细胞启动子

C.大肠杆菌启动子

D.农杆菌启动子

【答案】(1)总RNA(或mRNA) 如图3 (2)B

图3

说明:PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行,需提供DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物,4种脱氧核苷酸和耐高温的DNA聚合酶;同时控制温度使DNA复制在体外反复进行。PCR由变性→退火→延伸三个基本反应步骤构成。①变性:当反应体系温度超过90℃并保持一定时间后,双链模板DNA或经PCR扩增形成的双链DNA间的氢键断裂而解离成单链DNA,以便与特异性引物结合,为下一轮反应做准备。②复性:变性完成后,将反应体系的温度迅速降至50℃左右,特异性的引物就会和单链模板DNA的互补序列杂交。由于引物的物质的量远多于模板DNA,且模板DNA结构比较复杂,所以单链模板DNA间形成双链的机会很少。③延伸:将反应体系温度上升到72℃左右,溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)的作用下,根据碱基互补配对原则使DNA链按照5′→3′不断延伸,合成新的与模板DNA链互补的链。每经过一个循环,样本DNA片段数量增加一倍,经30余次循环,DNA产物量可扩增几百万倍。

2.诱发基因突变

【例2】(2018年,重庆调研)透明质酸酶在临床上常用作药物渗透剂,目前主要从动物组织中提取。科研人员尝试将透明质酸酶基因转入大肠杆菌,使其得到高效表达。如图4中NcoⅠ和XhoⅠ为限制酶,重叠延伸PCR是一种定点突变技术。据图4回答下列问题:

图4

(1)步骤①的目的是为了保护________,PCR的原理是________;PCR扩增的过程是目的基因DNA受热变性后解链为单链,引物与单链相应互补序列结合,然后________,如此重复循环。

(2)若图4中的透明质酸酶基因来自cDNA文库,则在进行步骤②之前需在其前、后端分别接上特定的________,否则该基因就不能转录。步骤②需要用________(填酶的名称)切割质粒。

(3)图4中A是________;早期实验人员利用大肠杆菌作为受体,后来发现用毛霉或酵母菌作受体更具优势,从生物体结构角度分析,最可能的原因是

。

(4)目的基因导入受体细胞后,是否可以稳定地维持和表达其遗传特性,只有通过检测和鉴定才能知道。检测转基因生物DNA上是否插入了目的基因的方法是

。

【答案】(1)透明质酸酶基因,防止NcoⅠ限制酶破坏目的基因 DNA双链复制 在DNA聚合酶作用下延伸

(2)启动子、终止子NcoⅠ和XhoⅠ

(3)基因表达载体 毛霉或酵母菌是真核细胞,有内质网和高尔基体加工

(4)利用目的基因制作成的探针进行DNA分子杂交

说明:重叠延伸PCR技术是指在PCR技术的基础上,采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,通过重叠链的延伸,将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术(图5)。引物2和引物3与模板链有部分不能互补的突变位点,而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此,分别利用引物1和引物2,引物3和引物4进行PCR扩增后,得到的DNA片段可以通过引物2和引物3互补的碱基杂交在一起,它们再在DNA聚合酶的作用下延伸,就能成为一条完整的DNA片段。最后,用引物1和引物4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检测定点突变是否成功。

图5 重叠延伸PCR示意图

3.检测目的基因

【例3】(2016年,海淀一模)用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时,得到如图6电泳图谱。其中1号为DNA标准样液(Marker),10号为蒸馏水,PCR时加入的模板DNA如图6所示。据此作出的分析,不合理的是

图6

( )

A.PCR产物的分子大小在250～500bp之间

B.3号样品为不含目的基因的载体DNA

C.9号样品对应植株不是所需的转基因植株

D.10号确定反应体系等对结果没有干扰

【答案】B

说明:PCR技术可用于检测已知目的DNA片段的序列:可以设计合成一对引物,也可以根据载体克隆位点两翼存在的恒定序列设计通用引物,抽提转化后的菌落中的质粒DNA,并作为模板进行PCR扩增。利用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物长度,如果长度和预期片段长度相同,则该转化克隆就可能含有目的序列。

4.检测目的基因的表达

【例4】早期胚胎细胞异常凋亡是目前克隆猪成功率低的主要原因。用实时荧光逆转录PCR技术(RT-qPCR)检测细胞凋亡抑制基因Bcl-2的表达水平,有助于了解胚胎发育不同时期Bct-2表达水平与细胞凋亡的关系(图7)。下列说法错误的是

图7

( )

A.对重组细胞进行培养时需加入血清、血浆等天然成分

B.卵母细胞采集后,要在体外培养成熟再去核作为受体细胞

C.根据RT-qPCR荧光强度可计算出基因Bcl-2在相应细胞中的翻译水平

D.胚胎在受体子宫发育过程中,其遗传特性不受影响

【答案】C