转基因作物培育中考点分析和应用

邵江樵

(浙江省宁波市效实中学)

自1996年首例转基因农作物产业化应用以来,全球转基因技术研究与产业应用快速发展。品种培育呈现代际特征,目前全球转基因生物新品种已从抗虫和抗除草剂等第一代产品,向改善营养品质和提高产量的第二代产品,以及工业、医药和生物反应器等第三代产品转变。转基因作物的种植不仅提高农作物产量,并且通过减少农药、化肥的使用,在改善农业生态环境方面也显示出巨大的优势。

转基因作物的培育需要经过目的基因载体的构建、载体的农杆菌转化、农杆菌与植株共培养、转化植株的筛选和鉴定四个环节(如图1)。以转基因作物培育为情景的试题已成为选拔性考试中的热点。

图1 转基因植物的培育示意图

考点1:Ti质粒的改造

Ti质粒是农杆菌介导基因转化的重要部件,它是农杆菌拟核区外的遗传物质,为双链环状DNA分子,包括T-DNA区、毒性区(vir区)、接合转移区和复制起始区4部分(如图2)。其中,T-DNA区和毒性区参与了外源基因的转移整合。

图2 Ti质粒

T-DNA区是根瘤农杆菌侵染植物细胞时,在相关蛋白的作用下被切割下来整合至植物基因组的一段DNA分子。该区段分布一些与激素合成相关的基因,其表达产物能引起植物细胞激素紊乱,进而导致在根茎交界处长出一团不规则的帽状结构——冠瘿瘤的形成,严重影响植物的生长。

毒性区(vir区)是位于T-DNA以外的一段DNA分子,其基因编码的蛋白质(如限制性核酸内切酶等)在T-DNA转移、整合中起辅助作用,其本身不会与植物基因组整合。

用于基因工程的载体分子量越大转化率越低,Ti质粒长度约200 kb左右,片段过大,不易操作。所以野生型Ti质粒需去除T-DNA区中的致瘤基因才能应用于植物基因工程。实践中常见的操作是双元载体系统:

微型Ti质粒含T-DNA;缺失vir基因;含有复制起点、标记基因和多克隆位点,能整合外源基因辅助Ti质粒含一整套vir区基因;缺失T-DNA区

两种质粒构建完成后,采用一定的方法将它们转入同一株农杆菌中,构成双元载体系统,就能使T-DNA整合至植物基因组中。

应用:植物被野生型农杆菌感染后会产生瘤状结构,主要原因是农杆菌的Ti质粒中含有生长素合成基因(A)、细胞分裂素合成基因(B)(如图3所示)。

图3

为防止农杆菌侵染植物细胞后使植物产生瘤状结构,必须把T-DNA片段上的基因________(用字母表示)敲除或替换掉。

【参考答案】A、B

考点2:双酶切

酶切的目的是使目的基因和Ti质粒之间具有相同的黏性末端,便于在DNA连接酶的催化下形成重组的Ti质粒。双酶切可以避免目的基因和Ti质粒的自身环化、避免反向连接,确保目的基因的顺利表达。对两种限制性核酸内切酶的选择需要考虑限制酶的识别序列,黏性末端、目的基因的转录方向和标记基因等。

应用:目的基因和Ti质粒的限制性核酸内切酶的酶切位点如图4所示,为了获得重组Ti质粒,应当挑选的限制性核酸内切酶是________。

图4

【参考答案】SalⅠ和KpnⅠ

【解析】为了使重组Ti质粒含有标记基因——青霉素抗性基因,不能选择限制酶ScaⅠ;又要切割目的基因左端,则必选限制酶SalⅠ;为切割目的基因的右端,在限制酶EcoRⅠ和KpnⅠ之间,需考虑目的基因表达的方向图示,只能选择限制酶KpnⅠ。

考点3:影响重组DNA分子(重组Ti质粒)形成效率的因素

构建好的基因表达载体需要包括目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点等。标记基因用于检测目的基因是否导入,启动子和终止子调控目的基因的表达,其中启动子的作用是与RNA聚合酶结合驱使目的基因转录出mRNA。重组DNA分子形成的效率受目的基因和载体的质量和浓度、是否有互补的黏性末端、DNA连接酶的活性和量、反应时间、反应温度和pH等因素的影响。

应用:当载体和外源DNA用同样的限制性内切酶,或是用能够产生________的同裂酶等切割时,所形成的DNA末端就能够彼此相匹配,可以被DNA连接酶(T4连接酶)催化生成________,形成重组DNA分子。但是,当靶片段(外源DNA)的末端与载体不匹配时,必须转换其中一个或两个片段的末端,以便使之连接。

【参考答案】相同的黏性末端 磷酸二酯键

考点4:重组Ti质粒导入时对农杆菌的处理

细胞处于能吸收和容纳外源DNA的状态称为感受态,经特定处理后处于感受态的细胞称为感受态细胞。处理常用的是氯化钙法:先将快速生长的农杆菌置于经低温(0℃)预处理的低渗氯化钙溶液中,会造成细胞膨胀,同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构(介于液态与晶态之间的结构,既有液体的流动性,又有类似晶体结构的有序性),促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,离开所在区域,诱导细胞成为感受态细胞。

当加入外源DNA后,Ca2+与外源DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物,并附着在细菌细胞膜的外表面上。再将该体系转移到42℃下经短暂的热脉冲处理(90 s),细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动,并随机出现许多间隙(孔洞),致使细胞膜通透性增加,便于外源DNA分子进入感受态细胞。

由于细胞膜的流动性,这种短时热冲击所致的间隙(孔洞)又可以被细胞自身所修复。

细菌细胞壁的成分是肽聚糖,壁的多孔性允许水和一些化学物质通过,大分子的物质不能通过,而CaCl2溶液处理可以使细胞壁出现孔洞,从而提高细胞壁的通透性。

应用:(浙江省2018年4月选考生物卷,节选)取CaCl2处理过的农杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作,使重组质粒进入农杆菌,完成________实验。在离心管中加入液体培养基,置于摇床慢速培养一段时间,其目的是________。

【参考答案】转化 使CaCl2处理过的农杆菌恢复细胞的正常状态

考点5:影响重组Ti质粒导入农杆菌效率的因素

在转化过程中,并不是全部受体细胞都会导入重组DNA分子,真正导入的只是少数细胞,影响重组Ti质粒导入农杆菌效率的因素有①重组DNA的质量和浓度;②农杆菌的生长状态与密度;③适宜的培养时间和条件等。

实验证明,大于30 kb的重组质粒将很难进行转化。转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入外源DNA的量过多或体积过大时,则会使转化率下降。一般DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%,1 ng的cccDNA(共价闭环DNA)即可使50 ul的感受态细胞达到饱和。

最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液,不要用已经多次转接,或贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳,密度过高或不足均会使转化率下降。

整个操作过程均应在无菌条件下进行,注意防止被DNA酶或杂DNA所污染,否则会影响转化效率或引起杂DNA的转入。整个操作均需在冰上进行,不能离开冰浴,否则细胞转化率将会降低。

应用:(浙江省2018年11月选考生物卷,节选)为提高将重组DNA分子导入受体细胞的效率,除考虑导入方法、筛选条件、防止污染外,还需考虑的主要因素有________________(答出2点即可)。

【参考答案】重组DNA的质量和浓度、受体细胞的生长状态与密度

考点6:筛选导入重组DNA分子(重组Ti质粒)的农杆菌

常用的方法为利用标记基因(抗性基因)在添加相应抗生素的选择培养基上培养筛选。

将目的基因导入植物细胞,采用最多的方法是农杆菌转化法。含有目的基因的农杆菌可根据标记基因进行筛选。若农杆菌在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上都可以生长繁殖,农杆菌中________(填“是”或“否”)含有目的基因。原因是________。

【参考答案】否 在构建重组质粒时,为防止目的基因和质粒自身环化、避免反向连接,可选用HindⅢ和SalⅠ两种限制酶,这样含有目的基因的质粒中抗四环素的基因被破坏

考点7:农杆菌侵染植物细胞的转化过程

图6 农杆菌侵染植物细胞的转化原理的示意图

转化过程如下:

①当植物受到创伤后,会分泌酚类化合物,吸引农杆菌移向植物细胞,然后与植物细胞相关受体蛋白特异性结合。

②农杆菌细胞膜上的相关受体蛋白结合酚类化合物后,使Ti质粒上的毒性区(Vir区)上的系列基因激活并表达出多种蛋白,包括DNA聚合酶和限制性核酸内切酶等。限制性核酸内切酶作用于T-DNA的底链上,将其切割形成单链T-DNA分子,单链T-DNA分子与特定蛋白结合形成不成熟T链复合物;另一些蛋白结合在农杆菌与植物细胞之间形成具有转运功能的通道,协助不成熟T链复合物和一些蛋白进入植物细胞中。在转运途中,不成熟T链复合物和有关蛋白结合,构成成熟T链复合物。

措姆呜呜地哭着，米九不停地揉搓着双手，措姆的声音又带着浓重的鼻音：我本来想生个孩子证明了自己，他会让我回去的，可万万没想到，他在我隆起大肚子时，娶了个更年轻，更漂亮的，让我彻底没了回家的路。米九低低地叹气：姆姆，人生还很漫长，说不定他老了就后悔了，他就会把你接回家。措姆幽幽地：他都娶第三个老婆了，我还有什么盼头？米九还是努力着让措姆开心：也说不准，他前些天还给我打探你的消息呢！措姆哀怨：你就骗我吧，每次你都这样说，可他看到我时躲得远远的，根本都不想见我。

③成熟T链复合物和一些植物细胞蛋白进一步识别结合,在植物细胞蛋白的协助下,经核孔复合体到达细胞核,最终在一些特定植物蛋白的协助下,含有目的基因的T-DNA与植物细胞基因组完成整合。

整合具有随机性:整合几个目的基因,整合到哪一条染色体,整合到染色体上的位置都是随机的。

应用1:(浙江省2018年11月选考生物卷,节选)农杆菌介导法是目前植物转基因的常用方法,该方法的基本过程是农杆菌感染植物时,________,并将其插入到受体细胞的基因组中。

【参考答案】携带目的基因的T-DNA转移到受体细胞

应用2:(浙江省2021年1月选考生物卷,节选)三叶青为蔓生的藤本植物,以根入药。由于野生三叶青对生长环境要求非常苛刻,以及生态环境的破坏和过度的采挖,目前我国野生三叶青已十分珍稀。

依据基因工程原理,利用发根农杆菌侵染三叶青带伤口的叶片,叶片产生酚类化合物,诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达形成________和限制性核酸内切酶等,进而从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段(T-DNA)。T-DNA进入叶片细胞并整合到染色体上,T-DNA上rol系列基因表达,产生相应的植物激素,促使叶片细胞持续不断地分裂形成________,再分化形成毛状根。

【参考答案】DNA聚合酶 愈伤组织

考点8:影响植物细胞转化效率的因素

从农杆菌介导法的转化原理可知,农杆菌的生长状态、农杆菌的菌液浓度、植物细胞对农杆菌的敏感性(来源、发育状态和基因型等)、共同培养的时间和温度、共同培养的pH、侵染方式、超声波、表面活性剂等因素会影响植物细胞转化效率。提高转化率的措施:①添加表面活性剂增强农杆菌和植物细胞间的吸附能力;②人为提高酚类化合物的含量,更加高效地激活vir基因表达;③采用超声波处理植物,使植物组织形成微伤口,增加农杆菌的感染概率;④添加抗氧化剂去除植物细胞由于农杆菌感染形成的过氧化物,减少植物组织培养中愈伤组织的褐化,提高转化效率。

应用:在利用农杆菌转化植物受体细胞的过程中,为了吸引农杆菌移向植物受体细胞,需添加________物质。

【参考答案】酚类

考点9:对宿主细胞的选用要求

宿主细胞应具备的特点:①具有优良性状;②有较高的遗传稳定性;③细胞全能性表达充分;④易被农杆菌侵染等。

应用1:(浙江省2020年7月选考生物卷,节选)为获得转基因植株,农杆菌侵染的宿主一般要选用具有优良性状、较高的遗传稳定性、________及易被农杆菌侵染等特点的植物材料。若植物材料对农杆菌不敏感,则可用________的转基因方法。

【参考答案】细胞全能性表达充分 显微注射

应用2:(浙江省2022年6月选考生物卷,节选)为提高培育转基因植株的成功率,植物转基因受体需具有较强的________能力和遗传稳定性。对培养的受体细胞遗传稳定性的早期检测,可通过观察细胞内________形态是否改变进行判断,也可通过观察分裂期染色体的________,分析染色体组型是否改变进行判断。

植物转基因受体全能性表达程度的高低主要与受体的基因型、培养环境、继代次数和________长短等有关。同时也与受体的取材有关,其中受体为________时全能性表达能力最高。

【参考答案】再生 细胞核 形态特征和数量 培养时间 受精卵

考点10:侵染后处理

与农杆菌共培养后的外植体表面及浅层组织中常常共生大量农杆菌,使转基因植物容易生冠瘿瘤,对外植体的正常生长会产生不利影响,必须进行脱菌培养以杀死和抑制农杆菌的生长。

方法:把共培养后的外植体转移到含抑菌剂——抗生素的培养基上继续培养生长,实现脱菌(去除农杆菌)和防止杂菌污染的目的。

选用的抗生素主要有青霉素类(羧苄青霉素、氨苄青霉素、青霉素g等)、头孢霉素类(头孢霉唑林钠、头孢霉哌酮钠、头孢拉定、头孢霉西林钠、头孢霉曲松钠等)和大环内脂类(红霉素、白霉素等),目前使用最多的是500 mg/L的头孢霉素。

原理:各种抑菌剂对细菌的作用机理不尽相同,青霉素类抗生素与蛋白质结合,抑制转肽酶交联反应,从而阻碍细胞壁粘肽的合成,使细菌的细胞壁缺损,菌体高渗膨胀裂解,进而诱导粘肽水解酶激活而溶菌;头孢霉素类抗生素对细菌的作用机理与青霉素类相似;大环内脂类抗生素是通过阻碍细菌蛋白质合成来抑制细菌繁殖。

通常需5～6次继代培养,直至培养基不产生农杆菌的菌落。

应用:(浙江省2021年1月选考生物卷,节选)依据基因工程原理,利用发根农杆菌侵染三叶青带伤口的叶片,叶片产生酚类化合物,诱导发根农杆菌质粒上vir系列基因表达形成DNA聚合酶和限制性核酸内切酶等,进而从质粒上复制并切割出一段可转移的DNA片段(T-DNA)。T-DNA进入叶片细胞并整合到染色体上,T-DNA上rol系列基因表达,产生相应的植物激素,促使叶片细胞持续不断地分裂形成愈伤组织,再分化形成毛状根。剪取毛状根,转入含头孢类抗生素的固体培养基上进行多次________培养,培养基中添加抗生素的主要目的是________。

【参考答案】继代 杀灭发根农杆菌

考点11:筛选转化体

在目的基因导入受体细胞时,并不是每个细胞的染色体上都会整合含目的基因的T-DNA,可以利用抗生素作为选择剂,用于筛选转化体。氨基葡萄糖苷类抗生素(卡那霉素、新霉素、潮霉素等)是常用的选择剂。抗生素抗性基因是筛选转基因植物常用而有效的标记基因,转基因植物中所用的抗生素抗性基因包括nptⅡ(提供卡那霉素、新霉素抗性)、aph(4)-Ⅰ(提供潮霉素抗性)、bla(提供氨卞青霉素抗性)、aae(提供庆大霉素抗性)等。

选择剂能够对转基因植物进行筛选实质上是抗生素抗性基因起作用。由于不同植物的不同外植体对抗生素的敏感性不一样,在转化之前应对选择剂设置一系列的浓度梯度,找出既能有效抑制非转化细胞生长,又对转化细胞影响较小的筛选剂浓度。

应用:通过生物工程技术对油菜进行改造,以得到含有基因A的油菜,流程如图7。

图7 转基因油菜的培育示意图

图7过程④中要防止杂菌污染的原因是________。可以通过在培养基中添加________作抑菌剂,理由是________。

【参考答案】杂菌会竞争培养基中的营养物质,还可能产生有毒有害物质 适宜浓度的潮霉素 重组质粒的T-DNA中含有潮霉素抗性基因,会与目的基因A一起插入油菜体细胞染色体的DNA上,它的成功表达使转化细胞具有对潮霉素的抗性而成活,而杂菌与非转化细胞由于潮霉素的作用死亡

考点12:目的基因在植物细胞中的检测

分子水平:用同位素标记的目的基因作探针,使用核酸分子杂交技术检测目的基因的转录;用抗原—抗体杂交技术检测目的基因指导的蛋白质的合成。

个体水平:对个体进行抗性试验。

应用1:(浙江省2019年4月选考生物卷,节选)将抗病基因通过转基因的方法导入植物的分生组织可获得抗病性强的植株。若在试管苗期间用分子水平方法判断抗病基因是否表达,应检测________(A.质粒载体 B.转录产物 C.抗性基因 D.病原微生物)

【参考答案】B

应用2:图8表示“华恢l号”抗虫水稻主要培育流程:

图8

组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造。图9是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图(示部分基因及部分限制酶作用位点),据图分析人工改造质粒时:

图9

①用限制酶Ⅰ处理,其目的是:去除质粒上的________和________(填基因),保证T-DNA进入水稻细胞后不会促进细胞的分裂和生长;要使抗虫基因能成功表达,还应插入________。

②若用限制酶Ⅱ分别切割经过①过程改造的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分子,并构成重组Ti质粒。分别以含四环素和卡那霉素的培养基培养已成功导入抗虫基因的水稻胚细胞,观察到的细胞生长的情况是:在含四环素的培养基中________,含卡那霉素的培养基中________。