类器官在呼吸系统研究中的应用

郑红莹，胡晓波

（1.成都中医药大学医学与生命科学学院，四川 成都 610000；2.成都市中西医结合医院/成都市第一人民医院呼吸与危重症医学科，四川 成都 610000）

肺（lung）是沟通人体内部与外界环境的器官，在各种外界因素（如烟雾、粉尘、细菌和病毒等）的长期暴露下，肺部疾病呈现出多样性和复杂性。疾病模型的相对不足是制约研究肺部疾病发生机制及药物治疗的最重要因素。类器官（organoids）是三维细胞培养技术的一种，它能模拟体内环境，构建出与体内器官有着相似形态学与细胞生物学特性的模型[1]。相比于价格昂贵且存在物种特异性差异的动物模型，类器官具有经济效益更高、耗时更短和遗传更稳定等优点[2]。作为一种新的体外模型，类器官可用于研究人体器官发育、疾病建模、药物筛选等多个方面。本文就类器官的培养、肺类器官的主要类型以及类器官在肺部感染性疾病、肺癌、慢性炎症性肺病、间质性肺病中的应用现状作一综述，以期为探索肺部疾病的发生机制及其治疗提供参考。

1 类器官的培养

类器官是干细胞在体外通过三维组织构建并定向分化为靶器官，形成与体内器官有着相似空间结构、分布的三维细胞复合体。干细胞的主要类型是多能干细胞和成人干细胞，细胞的来源可以是标准细胞系，或者是穿刺或手术切除的组织经过酶解得到的单细胞，以及癌症患者血液或转移性胸水中得到的癌细胞[3，4]。而细胞三维结构的建立则包括了细胞嵌入基质支架生长、细胞在重力与表面张力作用下通过固定培养基的液滴培养和细胞通过空气-液体界面在空气中极化与分化等方式[5]。类器官的生长还需要三维基质与细胞因子。三维基质是模拟体内微环境，并为细胞生长提供附着点和营养的关键物质。常见的三维培养基质是支架，类型包括基质胶、多孔膜特殊培养小室、水凝胶等[6]。实现类器官的长期体外培养，需要在基础培养基中添加相应物质，如促进增殖的表皮生长因子（EGF）、促进增殖分化的成纤维细胞生长因子等细胞因子以及皮质醇激素、抗生素等[7]。通过以上方式，研究人员已成功构建了脑[8]、心脏[9]、肠[10]、肝[11]、肾[12]、肺[13]等多个部位的类器官模型。

2 肺类器官

肺类器官是指细胞分化后产生的与人体肺有着类似形态和功能的三维细胞簇。目前主要将肺类器官分为2 种，分别是由正常细胞培养形成的气道类器官和由肿瘤细胞培养的肺癌类器官。

2.1 气道类器官 气道类器官是气道上皮细胞或肺泡上皮细胞构成的有着气管或肺泡样形态的三维模型。肺干细胞（基底细胞、肺泡细胞和气道分泌细胞）或多能干细胞是其主要来源。将支气管基底细胞在空气-液体界面培养，最终分化成为外层是基底细胞、内层是纤毛细胞的支气管球三维结构[14-16]。肺祖细胞与间充质细胞共培养时，肺祖细胞可在间充质细胞影响下向气道和肺泡结构分化[17，18]。将支气管上皮细胞、肺成纤维细胞和肺微血管内皮细胞在支持性3D 培养条件下共同培养，混合细胞群会快速凝结和组织，形成离散的上皮和内皮结构，产生多细胞管状气道类器官[19]。气道类器官具有人体呼吸系统的基础结构，在呼吸系统疾病建模、气道功能探索等方面已经有了相应的运用和探索，未来有望在肺部疾病的研究中取得进一步的成果。

2.2 肺癌类器官 肺癌类器官由肿瘤细胞培养形成，目前腺癌、鳞癌、腺鳞癌、小细胞癌和大细胞癌等各型肺癌类器官均能成功培养。这些肺癌类器官模型均表现出了对应类型的组织学和遗传学特征，部分模型更表达了其特异的生物标志物。如肺腺癌类器官能查看到腺泡、乳头等肺腺癌的病理特征，并表达其标志物napsin-A、甲状腺转录因子1（TTF-1）和细胞角蛋白7（CK-7）等[18，19]。肺鳞癌类器官显示了明显的细胞边界和细胞角化等鳞癌组织学特征以及特异性标记物p63 和CK5/6。肺腺鳞癌类器官则保留了腺癌和鳞状细胞癌的混合组织学特征。大细胞肺癌类器官显现了CK734 和CD133 的表达。小细胞肺癌类器官有神经内分泌特征和CD56、TTF-1 等标志物的表达[20]。总之，肺癌类器官拥有原发肿瘤的病理特征和基因谱，已应用于肺癌的发生机制、药物筛选以及精准治疗等多方面研究。

3 类器官在肺部疾病的应用

3.1 感染性肺病 呼吸道感染是造成肺部疾病的主要原因，感染因素包括细菌、病毒、支原体和衣原体等。研究人员已经开始运用类器官技术对病毒感染导致的肺炎进行研究。新型冠状病毒作为全球的公共卫生事件，会引起一系列呼吸系统症状，严重者可能危及生命[21]。肺类器官作为呼吸系统的研究模型，在新型冠状病毒的研究中发挥了作用。Katsura H等[22]通过研究感染了新型冠状病毒的肺类器官，发现新型冠状病毒会抑制肺泡Ⅱ型细胞表面活性剂的表达，初步探讨了新型冠状病毒在肺部的感染机制。Ebisudani T 等[23]通过新型冠状病毒感染模型，发现了洛匹那韦和瑞德西韦对新型冠状病毒的抗病毒作用。呼吸道合胞病毒（RSV）感染导致的肺炎是儿童住院和死亡的主要原因。Sachs N 等[24]在评估气道类器官用作RSV 体外感染模型时发现，感染了RSV的气道类器官出现了气道上皮的重塑和IP-10、RANTES 等细胞因子的大量分泌，提示RSV 感染的发生机制。Harford TJ 等[25]在研究产前RSV 感染对胎儿肺部结构和功能的作用时发现，感染了RSV的气道类器官出现了克氏细胞标志物CC10 和TRPV1 钙通道的表达增加，纤毛细胞标志物FoxJ1的表达降低以及E-钙粘蛋白结构的破坏，提示了RSV 可能的感染机制。类器官技术不仅被应用于肺部的病毒感染性疾病，在人体其他器官的病毒感染性研究中也发挥了作用，如肠道类器官被用于研究轮状病毒感染导致的腹泻等[26]。类器官技术在病毒感染性疾病研究中拥有的独特优势，有望在呼吸、消化、循环和泌尿等多个系统的病毒感染性疾病中发挥作用。

3.2 肺癌 肺癌类器官已应用于肺癌的发病机制、药物筛选和基因靶向精准治疗等多个方面。Nakamura H等[27]在肺腺癌细胞与肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）共培养形成的肺癌类器官模型中发现平足蛋白（Podoplanin）阳性的CAFs 可以调高肺腺癌细胞的增殖，推测Podoplanin 可能参与了肺腺癌的发病过程。Li YF 等[28]利用肺癌类器官生物库，对氯化白屈菜红碱、三尖杉酯碱、斑蝥素和小檗碱等多种天然化合物的抗肿瘤疗效进行了初步研究。Kim M 等[18]研究发现，奥拉帕尼抑制了乳腺癌2 号基因（BRCA2）突变的肺癌类器官的生长，厄洛替尼则抑制了表皮生长因子受体（EGFR）突变的肺癌类器官的生长。Wang Y 等[29]研究发现，吡咯替尼对人类表皮生长因子受体2（HER2）外显子20 突变的肺癌类器官有明显的抗肿瘤活性，并通过临床试验得到验证。虽然肺癌类器官已被广泛应用于肺癌的多项基础研究，但肺癌的发病与治疗相对复杂，单纯的肺癌类器官技术可能有一定的局限性。未来，伴随着其他新兴生物学技术（如基因编辑等）与肺癌类器官技术的结合，肺癌的研究可能会取得更多的成果。

3.3 慢性炎症性肺病 慢性炎症性肺病包括哮喘和慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）。类器官技术已被应用于上皮细胞修复、细胞增殖分化和肺气肿等与哮喘、COPD 发病过程有关的研究中。Wu X 等[30]在研究WNT-5A 和WNT-5B 对肺泡上皮祖细胞的作用时发现，两者均可抑制WNT/β-catenin 信号和肺上皮细胞培养生成的类器官数量，提示上皮细胞修复过程可能有非经典WNT 信号通路的参与。Wang A 等[31]在研究Gabrp（γ-氨基丁酸受体）对克氏细胞增殖分化的作用时发现，应用Gabrp 抑制剂后，小鼠克氏细胞增殖分化为杯状细胞的能力以及生成的类器官数量均被抑制，推测克氏细胞增殖分化过程中可能有GABA/Gabrp 信号通路的参与。Pouwels SD 等[32]在肺气肿发病机制的研究中发现，在细胞培养过程中用RAGE配体LL-37 或HMGB1 处理后，上皮细胞与成纤维细胞生成的类器官数量明显减少，但平均直径增加，提示RAGE 通路可能与肺气肿的发生有关。哮喘和COPD 的发病机制复杂，不能用单一的信号通路来解释其过程，未来还需要进行更多更深入的研究。

3.4 间质性肺病 间质性肺病是一组弥漫性实质性肺疾病，最终发展为肺纤维化和呼吸衰竭。类器官虽然已经应用于间质性肺病的研究，但目前主要处于疾病模型和相关信号通路的探索阶段。Mccauley KB 等[33]在研究气道类器官生成时发现，调节经典Wnt 信号通路可以使人类诱导多能干细胞（iPSC）定向分化为功能性气道类器官，并通过这种方式，建立了囊性纤维化患者特异性iPSC 衍生的有肿胀缺陷的气道类器官。Tan Q 等[17]使用人气道类器官模拟纤维化刺激反应时发现，TGF-β1 能抑制气道类器官的管状物对周围基质的侵袭，并且增加纤维化基因的表达。Chen YW 等[34]在建立气道类器官时发现，HPS1 与细胞纤维化存在相关性，推测HPS1 信号通路可能参与了肺纤维化过程。

4 总结与展望

类器官作为新兴的三维细胞培养技术，受到临床广泛关注。目前，国外已有大量类器官研究成果，国内部分实验室也开始了类器官的初步探索。类器官技术虽然在不断发展，但仍存在部分缺陷：①缺乏标准化的培养体系，同时培养方式根据目标和细胞的不同而不断变化；②相比于体内实验，类器官模型较为简单，无法完全再现体内微环境，且缺乏神经、血管等物质；③类器官的构建难度大，如培养生成的类器官数量少，肉眼无法进行准确观察。但即使类器官存在以上缺陷，类器官模型仍被广泛应用于发病机制、药物筛选、基因和靶向治疗等基础研究。同时，类器官技术也开始了与其他新兴生物工程技术相结合。总之，作为新颖的生物学技术，类器官在多种疾病的研究中（特别是病毒感染性疾病）已经展现了不可替代的优势，未来随着与其他新兴生物工程技术的结合，类器官可能会发挥出更大的应用价值。