细胞外囊泡在肺炎中作用机制及其诊疗研究

顾德芳，南 勇

（上海交通大学医学院附属松江医院<筹>急诊危重病科，上海 201600）

感染性肺炎（infectious pneumonia）是由各种原因感染导致的肺部炎症反应，部分患者可能因病情的加重、不及时就诊、营养不良、治疗中症状控制不佳、机体抵抗力下降等原因进一步发展为重症肺炎[1]。重症肺炎（severe pneumonia）具有治疗难度高、病死率高的特点，给患者及社会带来了极大的经济负担及医疗负担[2]。因此，早期诊断肺炎、早期制定合理的治疗方案、及时评价重症肺炎患者的预后，对于延缓肺炎的发展、降低相应病死率具有重要临床意义。细胞外囊泡（extracellular vesicles）是由于各种生理、病理和/或外部刺激后，从细胞膜或细胞内释放出来的一组异质性囊泡，是细胞间通信的重要介质和细胞行为的调节器，其内含有多种类型的RNA、蛋白质、脂质和细胞器，通过多种途径调节受体细胞的多种生物过程[3]。研究表明，细胞外囊泡具有作为某些疾病诊断和疾病预后的新型生物标志物的潜力[4]，而血浆细胞外囊泡和炎症发展有密切关系，特别是炎症与血液中细胞外囊泡水平的升高相关[5]。因此，细胞外囊泡在炎症的诊断、预后和治疗有望成为一个新的研究领域。本文现对细胞外囊泡的分类与作用、分离提取与鉴定、与重症肺炎的相互关系进行综述，旨在为重症肺炎敏感诊断方法及有效治疗措施提供参考。

1 细胞外囊泡的分类与作用

细胞外囊泡是由磷脂双分子层组成的球形无核微粒，其内包含多种mRNA、miRNA、蛋白质、受体、DNA 和生物因子等[6]。根据细胞外囊泡的颗粒大小将其分为三类：外泌体（Exo）、微囊泡（MV）和凋亡小体（AB）。①外泌体（30～100 nm）是粒径大小最小的亚群，富含mRNA、miRNA、DNA 和蛋白质[7]；②微囊泡（100～1000 nm）被称为脱落的囊泡、外小体、微粒或纳米颗粒，是第2 大的囊泡，其表达丰富的胆固醇、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂、神经酰胺和细胞表面特异性分子[8]；③凋亡小体（100～5000 nm）的粒径最大，是在细胞凋亡过程中由质膜起泡形成的，包含片段DNA、非编码RNA、组蛋白和细胞器等[9]。体细胞释放细胞外囊泡后通过与靶细胞相互作用后将其特定内容物作用到靶细胞，对靶细胞进行相应的生物调节。多种细胞来源的细胞外囊泡通常存在于血液、脑脊液、尿液、滑液、胸腔积液、精液、唾液和母乳等[10]。细胞外囊泡通过表面受体-配体相互作用、直接膜融合或细胞内吞等不同方式作用于靶细胞，这些作用可直接刺激靶细胞或转移囊泡内各种信息分子。

2 细胞外囊泡的分离提取与鉴定

细胞外囊泡的分离提取方法主要是超速离心法、密度梯度离心法、过滤和色谱法[11]。目前提取细胞外囊泡的首选方法是连续超速离心法，该方法方便、廉价，并且能够处理大量样品。细胞外囊泡的鉴定方式为：流式细胞术、酶联免疫吸附法、电子显微镜及纳米颗粒跟踪分析（NTA）等方法[12]。细胞外囊泡的鉴定最常用的方法是流式细胞术，其可检测囊泡的颗粒大小、浓度等指标。然而，荧光流式细胞术可根据细胞外囊泡表面抗原鉴别细胞外囊泡的细胞来源。电子显微镜主要用于评估细胞外囊泡的粒径大小、形态和表面特异性标记物。

3 细胞外囊泡在肺炎中的机制

3.1 促炎作用 研究表明[13]，初始的内皮损伤可诱导肺泡内皮细胞释放细胞外囊泡，暴露于感染性刺激后进而启动肺部严重的炎症反应。肺泡上皮细胞分泌的细胞外囊泡的浓度可随着炎症损伤增强而增加，细胞外囊泡通过巨噬细胞的活化来诱导或加重肺炎进一步的发生发展[14]。另有研究表明[15]，气管内脂多糖可诱导肺泡巨噬细胞释放细胞外囊泡进入损伤的肺泡，随后触发肺泡上皮细胞和中性粒细胞释放相应的细胞外囊泡。在急性呼吸窘迫综合征模型中，内皮细胞分泌的细胞外囊泡可以增加肺部中性粒细胞的募集，从而导致肺损伤的严重程度进一步加重[16]。细胞外囊泡内部特殊信息分子起重要作用。研究发现，肺炎克雷伯菌感染的小鼠的支气管肺泡灌洗液中，巨噬细胞来源的细胞外囊泡的miRNA-223 和miRNA-142 表达上调，并与抑制巨噬细胞激活相关[17]。Peñaloza HF 等[18]研究发现，多种细菌均能促进肺泡巨噬细胞细胞外囊泡中IL-36γ 的分泌，进而导致甚至加重肺损伤。Zhang S 等[19]研究结果提示，内皮细胞来源性细胞外囊泡还可以诱导肺泡中性粒细胞募集，增加TNF-α、IL-1β 和过氧化物酶等炎症因子的产生。研究显示，随着社区获得性肺炎的严重程度的增加，在患者血浆内的细胞外囊泡表达的细胞间粘附分子-1（ICAM-1）、主要组织相容性复合体Ⅰ（MHCⅠ）和MHCⅡ逐渐下调[20]，细胞外囊泡可能是通过诱导免疫激活的降低进而导致肺炎的进一步发展[21]。

3.2 抗炎作用 在肺炎病程中，部分炎性细胞分泌的细胞外囊泡具有明显抗炎作用。研究发现，白细胞或中性粒细胞释放的细胞外囊泡可能对肺损伤具有保护作用。体外实验研究发现[22]，利用携带α2-巨球蛋白的白细胞源性细胞外囊泡治疗，结果提示其可减弱内皮细胞的通透性、增强中性粒细胞的吞噬作用。Neudecker V 等[23]研究显示，中性粒细胞分泌的细胞外囊泡可能对巨噬细胞和肺泡上皮细胞有抗炎作用。Kolonics F 等[24]研究显示，静息的中性粒细胞释放的细胞外囊泡对其他中性粒细胞具有抗炎作用。中性粒细胞分泌的细胞外囊泡含有miR-223，可能对巨噬细胞和肺泡上皮细胞有抗炎作用[25]。

3.3 抗病毒作用 在病毒性肺炎中，细胞外囊泡与病毒的相互作用影响肺炎的疾病病程。研究表明[26]，在流感病毒感染过程中，肺部上皮细胞分泌的细胞外囊泡主要起到灭活病毒颗粒的保护作用，这些细胞外囊泡携带流感受体α2,3 和α2,6 连接的唾液酸，通过捕获病毒来发挥其抗病毒作用。此外，细胞外囊泡可以通过调节其目的细胞中抗病毒基因的表达来影响病毒的复制。研究发现[27]，在肺泡上皮细胞中过表miRNA-17-5p 可以通过下调抗病毒蛋白Mx1 来增强流感病毒的复制。流感病毒感染的小鼠肺泡上皮细胞分泌的细胞外囊泡携带细胞因子IL-36a，进而并促进小鼠肺泡上皮细胞和巨噬细胞分泌促炎细胞因子和趋化因子加重炎症发展[28]。

4 细胞外囊泡在肺炎诊疗中的应用

4.1 诊断 目前，多种细胞源性细胞外囊泡在肺炎中的诊断应用得到不断开发，并逐步应用于临床。由于大部分的实体组织细胞分泌的细胞外囊泡最终会进入血液循环，因此很容易通过静脉穿刺获取相关样本。Peñaloza HF 等[18]在不同时间点分析了53 例严重的社区获得性肺炎患者血清样本，4 种miRNAs（miRNA-126，27a，146a 和155）可以区分患者后期是否发展为急性呼吸窘迫综合征。Carpi S 等[29]研究发现，血浆细胞外囊泡上表面蛋白的特征可以区分慢性获得性肺炎患者曾经是否患有急性加重或社区获得性肺炎病史。细胞外囊泡中的1-磷酸鞘氨醇受体3 成为与急性肺损伤等炎症性疾病严重程度相关和预后判定的潜在诊断标志物[30]。除血液样本以外类型的样本也可能是生物标志物的有用来源，吸入性胸腔积液含有细胞外囊泡，其内的miRNA 含量可以提供有关积液的潜在病因信息，有助于区分积液源于肺炎、结核病或肺癌[29]。

4.2 治疗 细胞外囊泡治疗肺炎具有明显效果，已有大量研究结果为后续应用于临床治疗提供有力依据。在各种细菌或病毒诱导的急性呼吸窘迫综合征（严重的细菌性脂多糖诱导的肺炎或流感病毒感染）动物模型中，间充质干细胞分泌的细胞外囊泡可减轻肺部炎症和肺水肿的形成，具有较好治疗效果[31]。机体宿主细胞通过将病毒颗粒与其分泌的细胞外囊泡暴露的唾液酸结合来降低流感的传染性[26]。此外，细胞外囊泡还提供了药物靶向递送的良好性能[32]。Ma Q 等[33]研究了血小板源性细胞外囊泡作为药物递送载体的性能，将血小板来源的细胞外囊泡装载TPCA-1（具有抗炎作用的IKK-1 和STAT3 抑制剂）进行药物靶向，转运到炎症部位，具有较好的抑制肺部炎症细胞的浸润的效果。由于重症肺炎期间机体向血浆中释放细胞外囊泡的特点，通过抑制细胞外囊泡的生物学效应以期逆转重症肺炎的进展仍有待进一步研究。

5 总结与展望

细胞外囊泡在重症肺炎的发生发展病程中发挥重要作用，由于其负载多种生物信息分子的载体特性及其通过抽血可采集的便利特点，使其成为了理想的生物标志物。细胞外囊泡作为生物标志物在诊断重症肺炎和识别肺炎病因等方面具有重要作用。目前，针对细胞外囊泡或其内在特定miRNA 治疗肺炎/重症肺炎的实验研究已取得一定的成果。未来，细胞外囊泡在重症肺炎领域的应用值得期待，将细胞外囊泡设计成特殊靶向药物递送系统到炎症肺组织局部发挥作用，制备成疫苗预防呼吸道疾病及肺炎可能是未来研究热点。此外，现有研究报道的细胞外囊泡的相关作用及机制多来自于动物模型或体外细胞为基础的实验研究，期待相关临床研究的开展，以便更好地观察细胞外囊泡的临床应用潜能，为重症肺炎的诊治提供方向。