基于网络药理学探究功劳木治疗严重蜂蜇伤的作用机制及分子对接研究

韦廷求 杨胜淋 肖俊新 廖华锋 蒋小方

1.广西壮族自治区柳州市中医医院重症医学科，广西柳州 545001；2.广西壮族自治区桂林市人民医院血液内科，广西桂林 541000；3.广西壮族自治区桂林市中医医院重症医学科，广西桂林 541000

蜂蜇伤是急诊常见疾病代表，主要表现为局部皮肤红肿、刺痛、瘙痒，伤口处有瘀斑、瘀点等症状[1]，轻者可自行消退，重者可迅速出现多器官功能衰竭（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[2-3]，此外，毒液在蜜蜂叮咬部位的强效溶解酶作用会导致皮肤层明显局部水肿和坏死[4]。大黄蜂、黄蜂和蜜蜂造成的死亡占动物相关死亡总数的29.7%[5]。近年来，蜂蜇伤呈逐年上升趋势，成为一个日益严重的公共卫生问题[2，6]。

功劳木别名众多，土黄连为其别名之一。本课题组采用土黄连膏（土黄连干燥茎研磨，芝麻油调成膏状）外敷伤口联合CRRT治疗重症蜂蜇伤，均取得较理想的效果。通过临床观察，发现早期使用土黄连膏外敷伤口可减少机体对蜂毒的吸收，促进皮损恢复正常，这可能与功劳木的生物碱成分发挥作用有关，但具体作用机制尚不清楚。本研究通过网络药理学与分子对接技术预测功劳木治疗蜂蜇伤的核心靶点及机制，为后续试验研究提供理论基础和新思路。

1 资料与方法

1.1 功劳木化学活性成分筛选

1.1.1 搜索功劳木的活性成分并预测活性成分的潜在靶点 首先利用化学专业数据库（http://www.organchem.csdb.cn/scdb/）搜索“功劳木”的化学成分，再通过中药分子机制的生物信息学分析工具（BATMAN-TCM）（http://bionet.ncpsb.org.cn/BATMANTCM/），以 Score cutoff≥ 20，AdjustedP≤ 0.05 为标准筛选功劳木活性成分及其对应的靶点。同时以“Mahoniae Caulis”“功劳木”为关键词在PubMed（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、知网进行文献挖掘中药活性成分及其对应靶点，与中药数据库BATMAN-TCM和化学专业数据库互为补充和核对。

1.1.2 筛选得到功劳木化学活性成分对应的靶点 在PubChem中搜索1.1.1项下所得化合物的异构体SMILES号，并将其在在线数据库SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）进行靶点预测，将排名前15位的基因作为功劳木的可能作用靶点，与1.1.1项下得到的靶标进行补充和去重，得到药物成分的靶标。

1.2 疾病靶标的预测

通过人类基因综合数据库GeneCards（https://www.genecards.org/），以“bee sting”为关键词搜索，得到疾病相关基因。

1.3 功劳木治疗蜂蜇伤疾病靶点蛋白质相互作用网络（PPI）的构建及核心靶点的获取

将1.1.2项下得到的药物成分的靶标与GeneCards数据库得到的疾病相关基因取交集，将交集靶点通过STRING数据库构建PPI网络，置信度设置为0.7。用Cytoscape 3.9.10及其MCODE聚类插件获取网络核心靶点。

1.4 分子对接

借助PubChem数据库、ChemBio3D Ultra 14.0软件获取核心成分.mol2格式。将核心靶点通过蛋白数据库（protein data bank，PDB）（https://www.rcsb.org/）获取蛋白晶体结构并以.pdb格式保存。借助软件PyMoL 1.7.2.1去除蛋白的水分子，分离配体和受体，通过AutoDock Tools 1.5.6软件转换为.pdbqt格式，并寻找对接活性口袋，设置Gridbox坐标及大小。利用Vina进行分子对接，同时得到结合能打分值。

1.5 GO和KEGG通路富集分析

以P＜ 0.05为条件，将核心靶点进行GO和KEGG富集分析，并筛选重要GO条目及通路绘图。

2 结果

2.1 功劳木活性成分的预测

获得功劳木核心活性成分4个，分别为异粉防己碱、木兰花碱、药根碱、尖刺碱。

2.2 疾病靶标的预测

将得到的174个活性成分靶点与GeneCards平台获得的226个疾病相关靶点取交集，最终获得功劳木治疗蜂蜇伤的潜在靶点22个。

2.3 PPI网络的构建和核心靶点的获取以及疾病-药材-成分-靶点网络的构建

PPI网络图见图1A。使用MCODE聚类插件获得功劳木治疗蜂蜇伤疾病的8个核心靶点，分别为SLC6A4、ALOX5、HTR2B、HTR2C、HTR2A、PLA2G4A、PLA2G2A、PLA2G1B，见图1B。最后采用Cytoscape软件构建疾病-药物-成分-靶点网络，见图2。

图1 功劳木治疗蜂蜇伤PPI网络（A）及关键靶点（B）

图2 功劳木治疗蜂蜇伤的疾病-药物-成分-靶点网络

2.4 分子对接

配体与受体结合能小于0便可自发结合，结合能＜-5.0 kcal/mol则具有较佳的结合活性。分子对接结果显示核心靶点与核心成分结合能力较强，详见表1。

表1 有效活性成分和核心靶点对接评分

2.5 GO和KEGG通路富集分析

用R软件对8个核心靶点进行GO富集分析，结果见图3。KEGG富集分析结果显示，排在前20位的通路包括5-羟色胺能突触通路、花生四烯酸（AA）代谢通路、TRP通道的炎症介质调节通路等，见图4。

图3 功劳木治疗蜂蜇伤核心靶点的GO富集分析

图4 功劳木治疗蜂蜇伤核心靶点的KEGG富集分析

3 讨论

现代研究表明功劳木的生物碱类成分具有抗菌消炎、抗氧化、抗肿瘤、抗神经退行性疾病等多方面活性[7]。蜂毒成分复杂多样[8-9]，包括激肽类（肥大细胞脱颗粒肽等）、生物胺类（乙酰胆碱、组胺等）和酶类（胆碱酯酶、磷脂酶、蛋白酶等）等。蜂毒致病机制复杂，具体机制尚不清楚，血液净化是目前治疗蜂蜇伤的有效治疗手段，《胡蜂蛰伤规范化诊治中国专家共识》指出基础治疗亦非常重要[10]，但这些治疗要求特定的医疗环境与医疗设备，严重蜂蜇伤后短时间内很难得到血液净化治疗，而中医药具有简、便、廉、验的特点，蜂蜇伤后可快速进行土黄连膏外敷治疗，减少毒素吸收。

通过网络药理学分析得到核心成分和核心靶点，分子对接技术显示核心成分与核心靶点具有良好的结合活性。KEGG富集分析的重要通路中，花生四烯酸代谢通路、TRP通道的炎症介质通路为5-羟色胺能突触通路的下游通路。肥大细胞脱粒肽是蜂毒的一种主要成分，可诱导肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放组胺、血清素（5-HT），一旦从突触前轴突末端释放，5-HT就会与其中一个受体5-HT2（Gq偶联）结合，使磷脂酶A2（PLA2）活化，在脂氧合酶（ALOX5）的催化下，使膜卵磷脂水解产生AA，随后AA被代谢成具有生物活性的亲脂性化合物（类花生酸），类二十烷酸，包括前列腺素和白三烯，可调节血流动力学、炎症反应等[11-12]。PLA2水解膜卵磷脂还可以产生溶血磷脂，引起溶血[13]。

PLA2G2A为PLA2家族的成员，主要靶向细胞外磷脂，影响宿主抗菌防御、炎症反应和组织再生[14]。异粉防己碱可通过Gq蛋白抑制PLA2酶活化[15]。药根碱具有减轻氧化损伤、保护神经作用[16]。木兰花碱具有较强的抗氧化和抗炎特性[17]。尖刺碱是有效的ALOX5抑制剂，具有抗氧化特性[17]。严重蜂蜇伤导致急危重症，主要是因为皮肤接种了大量毒液，引起剧烈的炎症反应以及溶血等，导致肌纤维损伤引发重要器官功能紊乱[18]。

综上所述，功劳木治疗蜂蜇伤的分子机制可能是其有效活性成分参与调控5-羟色胺能突触通路、AA代谢通路、TRP通道的炎症介质调节通路等，调节关键靶点发挥抗溶血、抗炎、抗氧化等治疗作用。