吸入糖皮质激素对毛细支气管炎患儿血miR-302e、NF-κB RNA 表达的治疗观察

陈福将，吴超雄，蔡振荡，何丽丹

温州市中西医结合医院儿科，浙江温州 325000

毛细支气管炎是婴幼儿最常见的下呼吸道感染。NF-κB 是一种二聚体转录因子,参与炎症、宿主免疫反应、细胞黏附、生长信号、细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡[1]。近来的研究报道，NF-κB 通路在RSV 感染小鼠的气道炎症中具有关键作用[2]。研究显示，肿瘤坏死因子α（tumour necrosis factor-α，TNF-α），白细胞介素-8（interleukin-1，IL-8）和白?细胞介素-6（interleukin-1，IL-6）等细胞因子可以诱导NF-κB 过表达[3]；NF-κB 家族成员的RelA（p65）可以调节多个下游靶基因的转录活性[4]。研究证明，?miRNA 参与诱导肺内炎症，其与肺内炎症之间的关系及其作用值得进一步研究。目前为止，有关miRNA 在毛细支气管炎中的作用的研究报道不多。研究显示，在肺炎小鼠模型中，miR-302e 的表达降低，miR-302e 的过表达可减少炎症并抑制RelA，BRD4 和NF-κB 的蛋白表达[5]。本研究旨在观察吸入糖皮质激素对毛细支气管炎患儿 miR-302e、NF-κB RNA 表达的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

毛细支气管炎组：选取2021 年1 至9 月温州市中西医结合医院的毛细支气管炎住院患儿 60例，均为首次发病，无基础心肺疾病、无免疫抑制及免疫缺陷疾病；60 例患儿采用随机数字表法随机分成激素组和非激素组，非激素组常规予可必特、沐舒坦雾化吸入，气道阻塞严重者给予吸痰和氧疗；激素组入院后即加用普米克令舒（布地奈德悬浮液）雾化吸入，>2 岁1.0mg，<1 岁0.5mg，2次/d，连用5d。参考Bearman 等[6]提出的标准，根据入院临床症状（呼吸次数、哮鸣音、发绀情况、辅助呼吸机参与）评分分为轻度组、中重度组。对照组：收集同期本院保健门诊体检健康儿31 例，无个人和家族特应症（如支气管哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎等）病史。本研究通过温州市中西医结合医院伦理委员会的审查批准（伦理审批号：2021-L-040），并得到患儿监护人的知情同意。

1.2 方法

①血清标本采集：各组患儿于入院后次晨抽取空腹静脉血2ml，毛细支气管炎组在入院后第5 天再次抽取恢复期静脉血2ml，室温（20～25℃）放置60min，2000 转/分离心10min，留取血清-70℃冻存备测。② RT-PCR 检测：全血检测miR-302e、NF-κB（p65）RNA 的表达水平，各组患儿于入院后次晨另取空腹静脉全血2ml，毛细支气管炎组在入院后第5天再次抽取恢复期静脉血2ml，-70℃冻存备测。首先按照Trizol 试剂说明书提取总RNA，去除基因组DNA，加入引物酶RT 酶混合物I、RT 引物混合物、M-MuLV 反向转录酶反转录为cDNA；然后PCR 扩增，PCR 反应体系：2×SYBR 绿色qPCR 主混合物，正向引物、反向引物、cDNA、RNase 游离水。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上点样，电泳25min 后，用SmartView 凝胶数字成像系统扫描分析扩增产物条带，分别测定各扩增带灰度值，以各目的基因扩增带灰度值比内参照GAPDH 扩增带灰度值，作为其RNA 水平的指标。主要试剂来源：RT-PCR 试剂盒由Servicebio 公司提供，琼脂糖凝胶电泳检测试剂由北京索莱宝科技有限公司提供，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。应用2-△△Ct方法计算miR-302e、NF-κB（p65）RNA 相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 10.0 统计学软件对数据进行分析处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，正态分布的两组样本均数比较采用t检验，方差不齐者用t’检验,多组样本均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），方差齐者两两比较采用LSD检验，方差不齐者用DunnettT3检验，两两比较采用q检验。两变量相关分析采用Bivariate 过程的Pearson等级相关法，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料比较

毛细支气管炎患儿激素组与非激素组患儿的年龄、体质量、入院前病程及住院天数比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。对照组31 例，男15例，女16 例，平均（8.64±2.62）月龄，各组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 毛细支气管炎患儿激素组与非激素组临床资料比较（± s）

表1 毛细支气管炎患儿激素组与非激素组临床资料比较（± s）

2.2 急性期毛细支气管炎组与对照组血miR-302e、NF-κB（p65）RNA 表达水平比较

荧光定量RT-PCR 检测结果显示急性期毛细支气管炎激素组、非激素组患儿血miR-302e 的表达水平均显著低于对照组，NF-κB（p65）RNA 的表达水平均显著高于对照组，用2-△△Ct方法计算RNA 相对表达量，见表2。

表2 急性期各组血miR-302e、NF-κB RNA 表达比较（± s，pg/ml）

表2 急性期各组血miR-302e、NF-κB RNA 表达比较（± s，pg/ml）

注：与对照组比较，*P<0.01

2.3 恢复期毛细支气管炎组血miR-302e、NF-κB RNA 表达水平比较

荧光定量RT-PCR 检测结果显示：恢复期毛细支气管炎激素组患儿血miR-302e 的表达水平显著高于非激素组，而NF-κB（p65）RNA 的表达水平显著低于非激素组，应用2-△△Ct方法计算RNA 相对表达量，见表3。

表3 恢复期毛细支气管炎组血miR-302e、NF-κB RNA表达比较（± s，pg/ml）

表3 恢复期毛细支气管炎组血miR-302e、NF-κB RNA表达比较（± s，pg/ml）

2.4 相关性分析

两变量Pearson 等级相关法分析结果显示毛细支气管炎患儿血miR-302e 的表达水平与NF-κB（p65）RNA 的表达水平呈显著负相关（r=-0.727，P<0.01）；毛细支气管炎患儿血miR-302e、NF-κB（p65）RNA的表达水平与病情严重程度密切相关，其中miR-302e 的表达水平与入院临床症状评分呈负相关（r=-0.845，P<0.01），而NF-κB（p65）RNA 的表达水平与入院病情评分呈正相关（r=0.694，P<0.01）。

3 讨论

研究显示，支气管炎的气道具有NF-κB 家族（RelA 和NF-κB2）的上调,且具有较高水平的NF-κB诱导的TH2型细胞因子（白细胞介素10、13）[4]。最近的研究发现，RSV 感染毛细支气管炎小鼠存在RelA（p65）的高表达，抑制NF-κB/IL-33/ST2 轴可以减轻RSV 感染引起的急性细支气管炎[7]。Mishra等[8]认为NF-κB 调节许多促炎介质、黏附分子、呼吸道黏蛋白及生长和血管生成因子的表达，NF-κB通路激活在哮喘发病机制中发挥主要作用。

本研究结果表明，急性期毛细支气管炎激素和非激素组NF-κB（p65）RNA 的表达水平均显著高于健康对照组，与RSV 感染的毛细支气管炎小鼠NF-κB（p65）RNA 的高表达研究结果相一致[7]。另外本研究相关分析表明，毛细支气管炎组血NF-κB（p65）RNA 的表达水平与入院时评分呈正相关，表明毛细支气管炎患儿血NF-κB（p65）RNA 的表达水平与病情严重程度密切相关。

miRNA 在调节基因表达中起关键作用，在呼吸道病毒诱发的免疫反应中发挥重要作用，已引起越来越多的关注[10-11]。研究表明，哮喘小鼠肺组织中检测到多种miRNA 显著差异性改变，这些miRNA参与调节哮喘的气道炎症、转化生长因子β 信号转导以及包括凋亡和炎症在内一些信号通路[12]。Mi-RNA 是哮喘诊断和严重程度评估的有前途的工具[13]。有关miRNA 在毛细支气管炎中的研究报道不多，研究显示，miR-26b 在毛细支气管炎患儿血淋巴细胞中存在差异表达，可能参与了炎症的发生[14]。最近的研究发现，RSV 感染降低了气道上皮细胞中miR-34b/miR-34c 的表达，从而导致RSV 疾病中的黏液过度分泌[15]。Zhang 等[16]在严重RSV 相关肺炎的研究发现，显著上调的miRNA 有miR-1271-5p、miR-10a-3p 等，可能反映严重的RSV 相关性肺炎，这些miRNA 靶基因参与了NF-κB 信号通路。Xiao等[17]研究显示，miR-302e 通过抑制NF-κB 活化来抑制过敏性炎症，表明miR-302e 可能在过敏性疾病中发挥抗炎作用，并作为治疗过敏性疾病的新治疗靶点发挥作用。本研究结果显示，毛细支气管炎激素组、非激素组患儿血miR-302e 的表达水平均显著低于健康对照组，相关分析结果表明毛细支气管炎患儿血miR-302e 的表达水平与入院时评分呈负相关，表明毛细支气管炎患儿血miR-302e 的低表达与毛细支气管炎的病情密切相关，能反映毛细支气管炎的气道炎症程度。

研究发现，糖皮质激素在炎症过程中可以通过糖皮质激素受体介导调节miRNA 的表达，如参与炎症反应的miR-98、miR-155 和miR-511[18]。在感染性休克的研究发现，地塞米松刺激以浓度依赖性方式增加了败血性休克患者T 淋巴细胞的增殖，并显著降低了miRNA-155 的水平，认为糖皮质激素可能通过miRNA-155 途径调节T 淋巴细胞的增殖[19]。儿童哮喘的研究发现，miRNA 与长期吸入糖皮质激素反应密切相关，并证明miR-155-5p、miR-532-5p是吸入糖皮质激素反应的潜在药物基因组学预测因子[20]。本研究结果显示，经吸入糖皮质激素5d 后，恢复期毛细支气管炎激素组患儿血miR-302e 的表达水平均显著高于非激素组，而NF-κB（p65）RNA的表达水平显著低于非激素组，表明吸入糖皮质激素能上调毛细支气管炎患儿血miR-302e 的表达水平而下调NF-κB（p65）RNA 的表达水平。

综上所述，吸入糖皮质激素能上调毛细支气管炎血miR-302e 的表达，抑制NF-κB RNA 的表达从而发挥抗炎作用，在毛细支气管炎的治疗中具有重要作用。