环状RNA hsa_circ_103809 在结肠癌中的表达及其临床意义

张继超，滕贤麟，颜喜胜，林恒军，邱学科

1.金华市人民医院肿瘤肛肠外科，浙江金华 321000；2.金华市人民医院检验科，浙江金华 321000

近年来随着人们生活水平的提高，不良的生活饮食习惯导致结肠癌发病率升高，且已成为近年来发病率上升最快的恶性肿瘤，目前发病率高居第4位[1]。结肠癌细胞浸润可沿壁环行发展或沿肠管纵行发展，早期可无明显症状，易被患者忽视，从而耽误最佳的治疗时机[2]。因此，对结肠癌“早诊断、早治疗”可能是提高患者生存率与治愈率的重要途径。环状RNA（circular RNA，circRNA）进化保守，血清中表达稳定，可作为微小RNA（microRNA，miR）的分子海绵参与人体多项生理功能调控，成为肿瘤标志物的潜力巨大[3]。hsa_circ_103809 已被证实在多种恶性肿瘤中呈异常表达[4-5]，已有研究显示，该基因可通过miR-532-3p/叉头转录因子O4（forkhead transcription factor O4，FOXO4）轴对结直肠癌细胞的增殖和迁移进行调控[6]，但关于该基因与结肠癌患者预后及生存的相关报道较少。本研究拟对不同细胞株结肠癌细胞hsa_circ_103809 表达进行检测，以验证既往研究结果，再对结肠癌组织及癌旁组织中该基因的表达进行检测分析，并运用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线、Kaplan-Meier 生存曲线、Log rank 检验及Cox风险回归模型阐明hsa_circ_103809在结肠癌中的表达及其临床意义，为寻找结肠癌诊断标志物提供新思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2018 年6 月至2019 年6 月于金华市人民医院结直肠肛门外科且术后病理明确为结肠癌患者80 例为观察对象，纳入标准：①术后病理显示均符合结肠癌诊断标准[7]；②年龄35～75 岁；③均为首次确诊为结肠癌且首次进行结肠癌根治术者；④术前未接受放、化疗者；⑤病例完整者。排除标准：①肝肾衰竭者；②血液系统疾病者；③合并除结肠癌外其他恶性肿瘤者；④其他恶性肿瘤转移至结肠者；⑤传染性疾病者。男42 例，女38 例，年龄35～75 岁，平均（56.00±8.25）岁；病理分期：Ⅰ期16 例，Ⅱ期41 例，Ⅲ期23 例；分化程度：高分化27 例，中分化38 例，低分化15 例；肿瘤类型：腺癌65 例，黏液腺癌15 例；肿瘤位置，左半结肠44 例，右半结肠36 例。所有入组患者均知晓本研究内容，并签署知情同意书，获得金华市人民医院医学伦理委员会批准（伦理审批号：L20180336）。

1.2 实验细胞、试剂及仪器

结肠癌HCT116、SW480、DLD-1、SW620 细胞株及正常结肠上皮NCM460 细胞株均购自中国科学院上海生物细胞研究所。RPMI 1640 培养基购自（美国Sigma 公司，货号SLBT7314）；胎牛血清（上海依科赛生物科技有限公司，货号20210928）；直送风超净工作台（上海笃特科学仪器有限公司）；M5 型酶标仪（美国Mo-lecular Devices Spectramax 公司）；恒温培养箱（美国Nuaire 公司）；-80℃冰箱（东莞皓天鑫公司）；ABI Prism7500 PCR 仪（美国Applied Biosystems 公司）。

1.3 细胞培养

正常结肠上皮 NCM460 细胞株及结肠癌HCT116、SW480、SW620、DLD-1 细胞株解冻后使用RPMI 1640 培养基进行培养，并向培养基中加入10%胎牛血清及1%青霉素（100U/ml）、链霉素（100μg/ml），观察无漂起细胞后放入细胞培养箱中在37℃、5%CO2条件下培养，当细胞融合度超过80%时进行传代。

1.4 不同结肠癌细胞系hsa_circ_103809 检测

取各传代后对数期生长结肠癌细胞株及正常结肠上皮NCM460 细胞株，采用TRIzol 法提取各组细胞样品中总RNA，并设计hsa_circ_103809 引物，进行hsa_circ_103809 表达水平检测，反应条件：75℃预变性2min，90℃变性5min，72℃延伸0.5min，循环40 次，使用2-ΔΔCT法计算基因相对表达量。实验独立重复3 次。

1.5 结肠癌患者样本中hsa_circ_103809 检测

取结肠癌肿瘤组织及癌旁组织（距肿瘤边缘≥5cm）小块作为研究样本，体积为0.4cm×0.4cm×0.3cm，取材后迅速投入液氮中，术后转移至-80℃冰箱中保存。hsa_circ_103809 检测：取出结肠癌肿瘤组织及癌旁组织，冷研磨后采用TRIzol 法提样本中总RNA，并检测样本中hsa_circ_103809 表达。方法同1.3 中检测方法。

1.6 研究方法

对患者的临床资料进行分析，对比肿瘤组织与癌旁组织中hsa_circ_103809 表达差异，分析hsa_circ_103809 表达与临床病理学特征、复发及生存预后关系进行分析。末次随访日期为2022 年6 月31 日。

1.7 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件对数据进行分析处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，计数资料用例数（百分率）[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同肠癌细胞系hsa_circ_103809 表达

与正常结肠上皮NCM460 细胞相比，HCT116、SW480、SW620 及DLD-1 细胞中has-circ-103809 表达水平均降低，差异有统计学意义（P<0.01）。

2.2 肿瘤组织与癌旁组织hsa_circ_103809 相对表达情况

肿瘤组织与癌旁组织hsa_circ_103809 相对表达分别为（0.67±0.18）和（0.82±0.15）。与癌旁组织相比，肿瘤组织中hsa_circ_103809 相对表达量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 肿瘤组织hsa_circ_103809 表达及临床病理学分析

hsa_circ_103809 表达与结肠癌患者性别、年龄、病理分期无关（P>0.05），与分化类型、肿瘤类型、癌胚抗原（carcino embryonic antigen，CEA）水平有关，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 肿瘤组织hsa_circ_103809 的表达及与临床病理学的关系（±s ）

表1 肿瘤组织hsa_circ_103809 的表达及与临床病理学的关系（±s ）

2.4 hsa_circ_103809 表达对结肠癌的诊断效应分析

hsa_circ_103809 曲线下面积（area under curve，AUC）为0.736[95%CI:0.661～0.803）]，约登指数为0.375，截断值为0.726，即hsa_circ_103809 表达≥0.726 为高表达，反之则为低表达，敏感度为65.50%，特异性为70.80%，见图1。

图1 肿瘤组织hsa_circ_103809 表达对结肠癌诊断的ROC 曲线

2.5 结肠癌患者术后复发单因素及多因素分析

经随访，hsa_circ_103809 高表达复发率为22.58%（7/31），低表达复发率则为63.27%（31/49）。与hsa_circ_103809 高表达患者相比，低表达患者复发率明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。Cox单因素回归分析结果显示：肿瘤分化程度越低、肿瘤类型为黏液腺癌、CEA≥5ng/ml 及hsa_circ_103809低表达是影响结肠癌患者3 年内复发的危险因素（P<0.05）；Cox 多因素回归分析结果显示：肿瘤分化程度低及hsa_circ_103809 低表达是结肠癌3 年内复发的独立危险因素（P<0.05）。

表2 Cox 风险回归模型分析结肠癌患者术后复发的单因素及多因素分析

2.6 hsa_circ_103809表达与结肠癌患者累积生存时间的关系

对患者术后3 年进行随访，结果表明，3 年内共复发37 例，死亡23 例。术后首年内复发20 例，复发率为25%（20/80），死亡11 例，生存率为86.25%（69/80）；次年复发4 例，复发率为30%（24/80），死亡11 例，生存率为72.5%（58/80）；第3 年复发13 例，复发率为46.25%（37/80），死亡1 例，生存率为71.25%（57/80）。采用Kaplan-Meier 生存曲线及Log rank 检验对结肠癌患者生存函数进行计算，结果表明，与hsa_circ_103809 高表达患者相比，低表达患者生存时间明显缩短，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。

图2 结肠癌组织hsa_circ_103809 表达的生存曲线

3 讨论

结肠癌早期症状隐匿，且复发率高，生存率低[8]。目前，临床主要通过免疫组化、基因检测等多种检测手段提高结肠癌的诊断率，以达到“早发现、早治疗”，提高生存率的目的[9-10]，但仍未寻找到检测方便，且特异性高的结肠癌肿瘤标志物。circRNA在真核细胞中已发现数千种，其形态以特定的反向剪接机制形成环状，其中相当一部分已被证明具有一定的生物学功能[11]。近期孙林等[12]通过对3 例结肠癌患者肿瘤组织及癌旁组织样本进行circRNA 芯片筛查，并采用qPCR 进行验证，结果表明，共发现114 种circRNA 出现表达差异。Zhen等[13]通过基因芯片对10 例结肠癌患者肿瘤组织进行筛查，最终发现共110 种circRNA 上调，16 种circRNA 下调。此外，也有学者对circRNA 的具体功能进行深入研究，Chen 等[14]通过沉默hsa_circ_101555，观察发现其下游靶基因miR-597-5p 上调，继而提高周期蛋白依赖激酶6（cyclin-dependent kinase6，CDK6）表达水平，促进结肠癌细胞增殖、迁移。

既往的研究中显示，hsa_circ_103809 对肝癌的临床意义较多[15-17]，但对于结肠癌的研究并不深入。一项基础研究中显示，hsa_circ_103809 在结肠腺癌SW480 细胞中呈低表达，p21 表达升高，通过过表达技术证实hsa_circ_103809 具有较好的抑癌性，且具有降低线粒体膜电位及抗氧化应激的作用[18]。为了验证前人研究，本研究首先对HCT116、SW480、SW620 及DLD-1 结肠癌细胞株中hsa_circ_103809表达进行检测，结果表明，上述结肠癌细胞株较正常结肠上皮NCM460 细胞hsa_circ_103809 表达明显降低，与前人研究结果相吻合。为了进一步深入探讨hsa_circ_103809 基因在结肠癌肿瘤组织中的表达及临床意义，本研究对80 例结肠癌肿瘤组织及其癌旁组织hsa_circ_103809 表达情况进行检测，与癌旁组织相比，肿瘤组织hsa_circ_103809 表达明显降低，与细胞实验结果趋势相同，且hsa_circ_103809 在肿瘤组织中的表达与结肠癌患者性别、年龄、病理分期无关，与肿瘤分化类型、肿瘤类型、CEA 水平有关，说明hsa_circ_103809 可能与性别、年龄因素及结肠癌转移浸润能力无关，而与肿瘤恶性程度有关，且有潜力成为与结肠癌临床病理特征相独立的临床检测指标。

ROC 曲线结果显示，hsa_circ_103809 表达量在0.726 以下时可能导致结肠癌的发生。为了分析hsa_circ_103809 是否对结肠癌患者预后具有一定的评估价值，笔者对入组患者进行3 年随访，记录患者复发情况及死亡情况，采用Cox 风险回归模型对复发患者肿瘤化类型、肿瘤类型、CEA 水平及hsa_circ_103809 表达进行单因素及多因素回归分析，结果表明，肿瘤分化程度低、黏液腺癌、CEA≥5ng/ml 及hsa_circ_103809 低表达均是结肠癌复发的危险因素，其中肿瘤分化程度低及hsa_circ_103809 低表达均是结肠癌患者复发的独立危险因素。对随访期内死亡的患者进行Kaplan-Meier 生存曲线及Log rank检验，hsa_circ_103809 低表达患者生存周期明显短于高表达患者，说明肿瘤组织hsa_circ_103809 对患者预后具有一定的评估价值，其机制可能与hsa_circ_103809 调控miR-532-3p/FOXO4 轴，促进肿瘤细胞增殖有关[6]。

综上所述，hsa_circ_103809 低表达可能对结肠癌的诊断具有一定的参考价值，且是患者预后复发的独立危险因素，对患者术后3 年内死亡具有一定的参考价值。