辅助生殖中胚胎质量评估方法的研究进展

温美婷，孙虹

近年来不孕症发病率逐渐增加，部分患者需要通过辅助生殖技术(assisted reproductive technology,ART)实现生育要求。ART经过四十多年的飞速发展，取得巨大进步，然而其成功率依然不高。如何提高ART成功率成为研究热点，其中选择优质胚胎移植对ART成功与否至关重要。目前临床胚胎质量评估主要基于静态的形态学评估，该方法不能动态观察胚胎发育过程，无法了解胚胎基因组学异常。胚胎延时成像(time-lapse imaging,TLI)技术，可实现动态观察胚胎形态变化，并通过形态动力学参数评估胚胎质量。然而部分非整倍体胚胎能够呈现最佳的形态学[1]导致妊娠失败。近年来，胚胎植入前基因检测(preimplantation genetic testing,PGT)的应用，通过筛选染色体正常的胚胎移植，可显著提高胚胎植入率和临床妊娠率，但PGT技术的有创性以及高成本限制其在临床上的广泛使用。近几年随着对胚胎培养基的深入研究，发现培养基中胚胎组学和胚胎基因学与胚胎质量具有相关性，为无创性胚胎质量评估提供发展方向。本文拟介绍目前三类胚胎质量评估方法的现状和研究进展，总结分析各方法在胚胎质量评估方面的优缺点，为临床胚胎质量评估提供参考。

1 胚胎形态学评估

1.1 静态的胚胎形态学评估

静态的胚胎形态学评估主要在胚胎原核期、胚胎卵裂期、囊胚期进行评估。在卵细胞受精后16 h～20 h出现胚胎原核，称为原核期。Scott L等[2]对原核期胚胎以原核、核仁的排列、细胞质外观、核仁大小、数目和分布提出Z评分系统。2011年欧洲人类生殖与胚胎学学会指南根据原核的均匀性和核仁前体提出原核评分[3]。胚胎发生第一次有丝分裂进入卵裂期，卵裂期主要基于卵裂球数目、大小、均一性、细胞碎片、多核等形态进行评估。Istanbul 共识[3]根据卵裂球大小、细胞碎片、有无多核分为三个等级评估胚胎质量。国内将第3天卵裂期的优质胚胎定义为正常受精卵，且受精后第3天胚胎细胞数为7～9个、细胞大小符合发育阶段、碎片程度小于10%、无多核化的胚胎[4]。胚胎发育至第5～6天形成囊胚，综合囊胚扩张状态、内细胞团和滋养层细胞发育形成Gardner评分体系。静态的胚胎形态学评估仍然是临床评估胚胎质量最常用方法，但其无法准确反映胚胎发育潜能，原核期和卵裂期没有统一标准的评估方法，实验室技术人员评估胚胎形态时存在主观因素的影响，无法反映胚胎遗传学情况等问题。

1.2 动态的胚胎形态学评估

1.2.1 TLI TLI通常使用一个独立的培养箱，其中安装一个或多个集成倒置显微镜和数码相机收集胚胎图像，优化胚胎形态学评估，实现动态监测胚胎发育。通过连续性观察胚胎的形态、动态和时间参数变化，建立胚胎形态动力学参数模型评估胚胎质量。

1.2.2 TLI与形态动力学 Meseguer M等[5]展开一项多中心的回顾性研究，选择7 305个卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)周期胚胎，其中1 390个胚胎使用延时培养箱和使用首次提出的形态动力学多变量模型[6]评估胚胎质量，另外5 915个胚胎使用传统培养箱和静态形态学评估，发现延时培养箱培养和选择胚胎移植的临床妊娠率增加20.1%。研究指出临床妊娠率提高的原因可能有：① 严格控制和稳定的孵化条件；② 减少对培养箱内的胚胎处理；③ 增加胚胎发育信息对形态进行定性评估；④ 使用定量形态动力学参数来选择有活力的胚胎。Basile N等[7]在Meseguer M等[6]的研究基础上增加新的形态动力学参数评估，将胚胎植入潜力从A到E进行分类，发现A类至E类的植入率呈显著下降(“A”32%、“B”28%、“C”26%、“D”20% 和“E”17%，P<0.001)。同时，在一项前瞻性随机对照研究中，也发现延时培养箱和基于多变量模型选择的胚胎持续妊娠率为51.4%，而对照组传统培养箱和基于静态形态学评估持续妊娠率为 41.7%[8]。近来，Dal Canto M等[9]发现使用形态动力学选择第2天胚胎移植的妊娠率与冷冻囊胚移植的临床妊娠率相似(40.6% vs 45.7%)。通过延时培养箱和形态动力学评估胚胎质量，选择优质胚胎移植提高了妊娠率。Coticchio G等[10]进一步分析胚胎受精的形态动力学，提出原核染色质极化的动力学具有预测胚胎发育的潜力。在胚胎卵裂期，Yang SH[11]等建立预测囊胚形成的分层模型，其中A、B、C、D类囊胚形成率分别为80.0%、77.8%、53.7%、22.2%(P<0.001)。学者进一步提出在卵裂期2～8细胞阶段对预测囊胚形成更有价值(AUC=0.732)[12]，结合原核期和卵裂期形态动力学参数也可用于区分囊胚期的胚胎形态等级[13]。对于胚胎形态动力学参数应用仍在积极探索中，目前关于TLI和形态动力学评估的临床效果尚存差异，且此技术所需仪器价格昂贵、观察标本数量有限等问题尚未有效解决，形态动力学参数模型尚无统一标准，因此临床上未广泛应用。

1.2.3 TLI与人工智能 Tran D等[14]基于8个体外受精(IVF)实验室的延时数据，使用人工智能技术建立预测胚胎临床妊娠的深度学习模型，其模型预测胚胎植入和临床妊娠有效(AUC=0.93)，因其延时数据来自于两个不同孵化器系统，因此对于其他延时孵化器系统的适用性仍不清楚。Berntsen J等[15]基于115 832个胚胎的延时数据开发深度学习模型，其预测结果与囊胚分级呈正相关。另一方面人工智能分析模型通过预测无法植入的非整倍体胚胎，选择具有植入潜力胚胎移植，从而提高妊娠率方面也具有价值[16-17]。人工智能实现完全自动化的胚胎形态学评估，意味着更少的人工评估，能消除由于实验操作人员之间差异导致的偏差，目前其标准的预测模型尚未完全建立，其临床适用性待进一步评估。

1.2.4 TLI与胚胎染色体 在形态动力学参数中，Vera-Rodriguez M等[18]发现整倍体与非整倍体胚胎的原核消失时间和第一次胞质分裂开始之间存在差异。胚胎在发育至囊胚时，整倍体胚胎的形态动力学参数(原核数、t2、t3、t4、t5、tB、ICM 和 TE 等级)高于非整倍体胚胎[19]。一项Meta分析在探讨非整倍体胚胎和形态动力学的关系时，指出非整倍体在胞质分裂时具有延迟，表明延时的形态动力学在评估胚胎质量方面具有价值[20]。通过延时形态动力学评估了解胚胎染色体倍体情况，是无创评估胚胎质量的一个新方向，不仅能缩短胚胎移植的时间，还能降低ART治疗的成本。然而目前胚胎形态动力学与胚胎染色体的关系尚未完全确定，其相关评估模型需要更多的数据支持。

2 有创性胚胎植入前基因检测

通过检测胚胎染色体情况，移植染色体正常的胚胎，降低流产率，降低胎儿先天缺陷率等优势已形成临床共识。PGT主要是获取囊胚滋养外层(trophectoderm,TE)5～10个细胞后，使用基因诊断技术进行遗传学分析，从而得到胚胎染色体情况。PGT在高龄产妇、单基因病、反复植入失败、复发性流产患者的临床应用价值是肯定的。然而PGT的关键步骤之一是对胚胎活检，其操作如何避免对胚胎产生的损伤，安全地获得胚胎遗传物质仍是PGT面临的问题。Scott JR等[21]发现第3天卵裂期活检后胚胎植入率比未活检胚胎植入率减少39%，对囊胚行TE活检的胚胎植入率没有差异，造成这种差异也不能排除胚胎学家活检的经验和技术的影响。另外也有研究表明，去除大量TE可能与较低的出生率有关[22-23]。同时，在活检时收集细胞的位置可能影响胚胎植入前非整倍体检测(PGT-A)的结果[24]。并且TE活检无法完全代表内细胞团(inner cell mass,ICM)的情况，因TE和发育成胎儿的内细胞团中的染色体数量并不总是相同，所以胚胎嵌合体会影响TE活检的准确性[25]。因此目前PGT仅针对某些特定人群使用，未在临床上广泛使用。

3 无创性胚胎质量评估

3.1 胚胎组学

3.1.1 胚胎代谢组学 研究中采用光谱分析培养基中胚胎代谢物的变化，检测培养基中代谢物含量，进而评估胚胎质量。Brison DR等[26]提出测量氨基酸浓度变化有助于胚胎筛选。Huo P等[27]使用高效液相色谱分析第3天胚胎移植后培养基中的8种氨基酸，发现丝氨酸、天冬氨酸、组氨酸和丙氨酸在妊娠组和非妊娠组之间差异有统计学意义，以90.4%的准确性预测胚胎植入潜力。由于研究中收集第3天培养基且样本量有限，因此在其他时间收集培养基产生的结果需要进一步研究，还需更大样本量来支持此结果。近来，Olcay IO等[28]发现非整倍体培养基中酪氨酸浓度显著高于整倍体(P<0.003)，提出培养基中酪氨酸水平≥76.38 mmol/L可视为非整倍体。学者们也发现胚胎培养基中某些特异性物质与胚胎发育潜能有关,如较高的人可溶性白细胞抗原G(sHLA-G)浓度与临床妊娠率有关[29]。一项回顾性研究发现培养基中 sCD146浓度高，其胚胎着床率较低[30]。有学者研究培养基中的细胞因子，发现优质胚胎培养基中 CCL15、CCL27和 CXCL12 的浓度升高，认为细胞因子可用于预测胚胎质量[31],其研究样本量较小，且不孕症的原因具有异质性，需要大样本量的进一步研究来阐明细胞因子水平与临床妊娠率之间的关联。

3.1.2 胚胎蛋白组学 随着转化技术的进步，可以检测胚胎培养基中蛋白质分泌或消耗的情况，了解胚胎蛋白组学与胚胎发育的关系。Dominguez F等[32]发现植入胚胎与未植入的胚胎之间，IL-6蛋白含量存在显著差异，提出IL-6 蛋白是选择囊胚的潜在预测指标。Bori L等[33]将蛋白质组学特征和TIL结合，建立人工智能模型，通过回顾性研究发现通过使用IL-6和MMP-1的人工智能模型预测活产(AUC=1.0)，其研究仅涉及一个实验室和一种培养基，对其他实验室的实用性还不确定，进一步研究应具有更大样本量和来自多中心的不同延时系统数据。也有学者提出囊胚培养基中IL-6和MMP-1浓度结合TLI预测胚胎整倍体准确度超过80%[34]，然而仍面临胚胎数目较少，样本量不足，且检测蛋白质的技术敏感性不高等问题。

3.1.3 胚胎转录组学 转录组是细胞中核糖核酸转录物的总称；通过对mRNA分析得出细胞特异性基因表达的特征进而了解细胞代谢的动态。Yan L等[35]发现人类外胚层细胞和人类胚胎干细胞的生长具有显著不同的转录组。Sanchez-Ribas I等[36]通过分析21三体、21单体和整倍体囊胚的转录组，发现21单体和整倍体囊胚之间HSA21的转录组存在差异，以及21单体和21三体囊胚转录组之间存在更大的差异。Zhou Q等[37]收集第3天和第5天胚胎培养基发现miRNA的表达在不同胚胎发育阶段浓度不同，piRNA 有大量的表达，指出培养基中的游离的RNA可能是与胚胎质量相关的潜在标志物。

3.1.4 胚胎表观基因组学 表观遗传是指在DNA序列不发生改变的情况下，基因表达和功能的诱导及维持发生了可遗传的变化。DNA甲基化和染色质状态是胚胎发生中的关键表观遗传指标。Li L等[38]发现 DNA 甲基化与受精卵中启动子的染色质可及性和整个植入前发育之间呈负相关。Zhou F等[39]通过分析来自65个植入期胚胎的8 000 多个单个细胞，发现在植入过程中，原始内胚层谱系细胞中基因组的重新甲基化比外胚层和滋养外胚层谱系的细胞慢得多,提出外胚层和原始内胚层的DNA甲基化具有明显的重建特征。Rosenbluth EM等[40]在培养第5天的新鲜囊胚培养基中发现，非整倍体培养基和失败的IVF周期培养基中含有较高水平的MicroRNA，提出MicroRNA可能是胚胎非整倍体和妊娠失败的生物标志物。

胚胎组学作为评估胚胎质量的新兴研究，其无创性和不限定特定的生物标志物凸显了临床优势。现已证明胚胎组学与胚胎质量具有相关性，然而目前研究局限于研究样本量较少，没有建立胚胎组学相关技术平台，也没有评估胚胎质量的确切标准。对于胚胎代谢组、转录组学、蛋白组学和表观基因组学还需要更大规模的研究来探索不同组学的特征，研究其来源机制，构建其预测模型，建立其评估技术，从而进一步研究来阐明组学与胚胎质量之间的关系，解决胚胎组学评估方法在临床开展的应用问题。

3.2 无创性植入前基因检测

无创植入前基因检测又称无创胚胎染色体筛查技术(noninvasive embryonic chromosome screening technique,NICS)，其通过检测胚胎培养基中的染色体进行遗传学分析，从而了解胚胎染色体情况。Stigliani S等[41]首次发现胚胎培养基中存在游离的DNA(cell-free DNA,cfDNA)。进一步研究发现cfDNA与囊胚形成和胚胎植入具有相关性[42]。Huang L等[43]将52个经过TE活检后冷冻的囊胚解冻，单独培养24 h后收集培养基，使用全基因组扩增和下一代测序技术进行非整倍性的无创性植入前基因检测(non-invasive preimplantation genetic testing for aneuploid，niPGT-A)，将镶嵌百分比为60% 作为区分非整倍体和整倍体胚胎的阈值以及去除变异系数大的样本，保留变异系数<0.19的样本分析，发现niPGT-A和TE活检PGT-A的阳性预测值分别为91.7%(33/36)和78.0%(32/41)；niPGT-A和TE活检PGT-A的特异性分别为80%(12/15)和50%(9/18)；与TE活检相比，假阴性率为0%，认为niPGT-A 比TE活检 PGT-A更优。此研究样本量较小，大部分捐赠的胚胎经TE活检检测为非整倍体，限制了样本的普遍性；胚胎之前已经过活检、冷冻后在第 5 天或第 6 天解冻，因此研究结果无法替代临床普遍情况。

Fang R等[44]对双方染色体正常和至少一名伴侣染色体重排夫妇的164囊胚培养基中cfDNA进行全基因组扩增和下一代测序，发现染色体重排夫妇的95个胚胎NICS的结果中，41个胚胎(43.2%)是整倍体，31个(32.6%)是非整倍体，17个(17.9%)显示嵌合体，其中6个胚胎(6.3%)中无法确定倍性；正常核型夫妇的75个胚胎NICS结果中，38个(50.7%)为整倍体，21个(28.0%)为非整倍体，16个(21.3%)为嵌合体；囊胚移植后总体临床妊娠率为58%(核型正常夫妇为 64%，染色体重排夫妇为 52%)，这与当前研究基于下一代测序的染色体重排患者接受PGT的研究中报道的45.1% 的妊娠率相似[45]。NICS标本来自培养基，从而避免有创性胚胎操作，降低对胚胎的伤害，降低活检的费用，增加广泛开展的适用性，但同时它容易受到精子和卵丘颗粒细胞的污染[46-47]，且使用胚胎培养基中游离的DNA进行扩增时，其扩增率均无法达到100%[44,46]。近来研究者发现，niPGT-A和TE活检之间的倍性一致率在第5天囊胚组为72.6%，在第6天囊胚组为 84.8%[48]，提出cfDNA量与胚胎培养时间相关。NICS可能成为有创性PGT-A的替代方法,然而样本污染、样本扩增率等问题尚未有效解决。

4 总结与展望

如何找到一种快速、客观、准确、全面且无创的胚胎质量评价方法，选择最具有潜力的胚胎移植，提高ART的成功率，是仍未解决的难题。静态的胚胎形态学评估仍然是临床评估胚胎质量最常用的方法，TLI及胚胎形态动力学参数的提出，给胚胎形态学评估提出新方向，但均存在无法判断胚胎染色体是否异常的情况。胚胎植入前遗传学检测技术虽然通过对囊胚滋养外胚层细胞进行遗传学分析，得到相关胚胎染色体信息，但因其对胚胎是有创操作以及存在胚胎嵌合状态影响胚胎评判结果的情况，其实施有一定的局限性，仅限于有相关准入资质的医疗机构开展。目前处于研究热点的无创胚胎质量评估方法，通过对胚胎培养液中的代谢产物以及cfDNA的检测来评估胚胎发育潜能，虽然解决了对胚胎有创操作的问题，但通过微量代谢产物获得的信息是否能反映胚胎的真实状态，还有待进一步的大数据的研究确定。

综上所述，基于传统的静态胚胎形态评估方法产生的一系列新的胚胎评估方法，均具有各自优势，但仍面临着某些尚未解决的问题。将新的胚胎评估方法与胚胎形态学评估相结合，将有望进一步提高胚胎质量评估的准确性，进而提高辅助生殖技术的成功率。