植物发育相关miR828基因家族靶基因预测及生物信息学分析

韩雪杨，刘 宁，温 鑫，魏继承，任如意，郝爱平

(牡丹江师范学院 生命科学与技术学院，黑龙江 牡丹江 157011)

Micro RNA(miRNA)是真核生物体中内生的，长度约20～24个核苷酸[1]，具有一定的保守性、时序性和结构特异性的非编码小分子RNA。miRNA调控植物的生长发育、信号转导和对外界环境非生物胁迫的响应等生命活动[2]。一个miRNA可能具有一个或多个靶基因，且miRNA一般都是通过对靶基因的切割和翻译抑制来调控靶基因[3]。miR828是miRNA家族的重要成员，在植物的生长发育中起着重要的作用。例如，研究人员为了证实miR828参与苹果果皮花青素的生物合成，将携带35S：miR828载体的农杆菌注射到“新红星”苹果的果皮中。研究表明，过表达的miR828抑制了注射部位花青素的积累，而注射含有空载体的农杆菌后花青素含量没有减少[4]。由此可见，miR828对苹果花青素积累具有负向调控作用。miR828在凤梨中参与编码MYB家族成员的mRNAs的转录后基因沉默，可推测其具有调节苞叶变种凤梨显现出红色果实性状的功能[5]；miR828和TAS4 D4(-)在马铃薯块茎色素组织中高度表达，可能是负调控因子[6]；百合花被中MYB12的mRNA主要在第10和第11个核苷酸之间被miR828裂解，因此，miR828可能抑制花芽发育过程中MYB12转录物的积累，从而抑制花被下半部分花青素的生物合成[7]；miR828在拟南芥中过表达导致MYB转录因子表达水平降低，花青素水平降低[8]。miR828在着色的葡萄果实中大量积累，并抑制葡萄MYB114的表达，使花青素含量降低[9]。

目前，多个miR828家族成员已被鉴定，但该家族成员在各植物中的数量分布、靶基因的预测、进化关系及其功能的比较研究较少。为全面了解植物miR828家族成员进化与功能特征，本研究以PmiREN数据库中记录的植物miR828为研究对象，通过生物信息学方法，对物种分布、前体结构、靶基因功能等进行研究，为该家族成员的进一步开发利用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 植物miR828数据的获取

在PmiREN(Plant miRNA ENcyclopedia)数据库(http：//www.pmiren.com/)中检索下载miR828家族成员的成熟序列及前体序列。

1.2 染色体定位分析

用得到的miR828家族成员的前体序列在NCBI(https：//www. ncbi.nlm. nih. gov/)中通过BLAST基因组序列获得miR828家族成员的染色体定位。

1.3 序列比对

通过Web Logo 网站(http：//weblogo.threeplusone. com/)分析miR828家族成员成熟序列的保守情况。

1.4 前体二级结构分析

利用RNAfoldWebServer(http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi)在线预测miR828成员前体的二级结构，参数值默认。

1.5 进化树分析

利用MEGA 10.0 软件，采用邻接法(neighbor-joining，NJ)构建miR828家庭成熟序列系统发育树添加Boot-strap设为1 000次。

1.6 靶基因预测

使用psRNATarget网站(http：//plantgrn.noble.org/psRNATarget/)在线预测miR828家族成员的靶基因，获得靶基因。

2 结果与分析

2.1 植物miR828家族成员统计与分析及染色体定位

通过PmiREN数据库共获得45个miR828基因家族成员的前体和成熟序列。由表1可知：miR828仅分布在被子植物中，共25个植物物种，其中15种为双子叶植物，pre-miR828和miR828的数量分别为34个；3种为单子叶植物，pre-miR828和miR828的数量为3个。各物种间miR828家族成员数量不同，pre-miR828和成熟miR828数量之间比例关系接近1∶1。

2.2 植物miR828家族的序列分析

植物成熟miRNAs 在植物进化过程中高度保守。通过WebLogo在线软件对植物miR828家族的成熟序列进行分析，每一列字母的总高度表示该位置序列的保守性，每一列符号的高度表示对应氨基酸的相对频率。根据图1分析发现，仅在第8和第11个碱基处存在碱基多样性，说明miR828序列一致性较高，在植物种间的保守性较强。其中一致序列为TCTTGCTCAAATGAGTATTCCA，该序列即为大部分miR828序列(图1)。

图1 植物miR828成熟序列的保守性分析

2.3 植物miR828家族前体序列二级结构分析

pre-miRNA 二级结构及成熟mRNA序列位置的研究，对序列切割和折叠预测具有重要的参考价值。本研究通过RNAfold web server在线软件对部分miR828家族成员的pre-miR828二级结构进行预测，结果发现，植物miR828家族成员都能形成稳定的茎环结构(图2)。主要分为3种类型：①产生1条成熟miR828，位于pre-miR828的3′端；②产生 2条成熟miR828，分别位于pre-miR828的3′端和5′端；③产生1 条成熟miR828，位于pre-miR828的5′端。这些不同类型的miR828可能在植物中发挥了不同的作用[10]。

2.4 植物miR828家族进化树分析

通过对植物miR828基因家族成熟序列对比并构建系统发育进化树分析，结果表明(图3)，27种植物分为4个大的分支，Qro-MIR828单独为一个分支，可能由于其前体和成熟序列变化较大，Aly-MIR828、Ath-MIR828、Aof-MIR828聚在一个分支下，Sha-MIR828、Vun-MIR828、Csi-MIR828a、Csi-MIR828b、Csi-MIR828c、Csi-MIR828d、Mdo-MIR828a、Mdo-MIR828b、Mol-MIR828a，Mol-MIR828b、Cro-MIR828a、Atr-MIR828、Mac-MIR828聚在一个分支，其余聚在一个分支下，表明其亲缘关系较近。与此同时，参考了miRNA数据库PmiREN中成熟序列表达位置和RPM值信息，发现Ath-MIR828主要表达位置为植物的根、花序、幼苗等部位；Aof-MIR828主要表达位置为全株植物，而Qro-MIR828仅仅在植物的叶中表达，因此结合进化树分析，可解释Qro-MIR828成熟序列与另外一些成熟序列差异较大，表明Ath-MIR828和Aof-MIR828亲缘关系更近，其中分支数字较小可能是由于其序列差异较小。另外，还发现Csi-MIR828a、Csi-MIR828b、Csi-MIR828c、Csi-MIR828d主要在茶树(山茶科)中表达；Mdo-MIR828a和Mdo-MIR828b主要在苹果(蔷薇科)中进行表达；Aly-MIR828和Ath-MIR828都在拟南芥(十字花科)中表达，说明在同科物种中MIR828成熟序列有比较近的亲缘关系。

图3 植物miR828家族进化树分析

2.5 植物miR828家族靶基因分析

miRNA通过特异性剪切靶标 mRNA、阻止靶标mRNA翻译等方式调控基因表达。预测并分析靶基因，对于深入了解miR828家族功能特征及其进化规律具有重要意义。利用psRNATarget数据库对植物miR828家族靶基因进行预测，分析发现，miR828家族靶基因包括结构域蛋白、转录因子、载体蛋白、泛素连接酶等。其中多数为MYB转录因子及MYB结构域蛋白，如Aly-MIR828、Aof-MIR828、Mac-MIR828。由此说明，MYB转录因子基因是miR828家族的重要靶基因。通过研究发现，这些基因主要参与了RNA的合成、转录调控、色素合成、代谢调控和基因表达调控等过程。有科研人员通过研究发现，miR828参与了毛白杨茎发育过程中木质素生物合成的特异性调控。miR828 在茎发育过程中优先在次级维管组织中表达。通过降解组分析和绿色荧光蛋白信号检测，两个MYB基因(MYB171 和 MYB011)被验证为 miR828 的直接靶标。miR828 在杨树中的过表达下调木质素生物合成基因，导致细胞壁中木质素含量降低[12]。在甘薯中，miR828的表达仅在叶片中检测到，并且是由伤害诱导的。此外，环磷酸鸟苷(cGMP)是创伤后miR828在叶片中积累所必需的。通过cDNA克隆获得了两个miR828候选靶点，命名为IbMYB和IbTLD，并通过研究证实了它们对miR828的mRNA切割作用。此外，过度表达miR828前体的转基因甘薯影响了木质素和H2O2的含量。这些结果表明cGMP可以调节创伤反应性miR828，抑制IbMYB和IbTLD的表达[13]。上述研究表明，miR828参与调控植物细胞壁木质素合成和逆境胁迫应答。此外，现在已有大量数据表明，miR828的靶基因是MYB113和TAS4。野生型拟南芥植株的花青素合成量比转入了miR828过表达载体的转基因植株高很多，这说明miR828抑制了拟南芥花青素的生物积累[11]。光诱导下调BrimR828可以作用于BrTAS4、Brpap1(Bra039763)、MYB82(Bra022602)，负向调控其转录水平，从而积累MYB转录因子来正调控白菜幼苗中花青素的生物合成[14]。在miR828过表达转基因番茄植株中，miR828的靶基因、花青素合成相关酶基因的表达量均明显下降，花青素含量测定结果也显示，miR828过表达使得番茄中花青素含量较野生番茄明显降低，可知miR828可以负调控番茄中花青素的合成[15]。以上研究表明，miR828主要通过调控靶基因MYB降低植物中花青素积累而发挥作用，这为将来观赏植物花色及叶色改良品种研究提供了参考，miR828其余靶基因功能还有待进一步研究(表2)。

续表2 Continued Table 2

3 讨论

MicroRNAs(miRNAs)是生物体内大量存在的20～24个核苷酸的非编码RNA，在生物体中发挥着重要作用，因此miRNA的鉴定和分析具有重要的意义。传统的对miRNA研究需要一系列复杂的操作过程，在现实中实施难度较大。随着生物信息学的发展，多种多样的计算方法被应用在生物学研究中。利用软件和在线网站即可对不同物种的miRNA及其靶基因进行预测与分析。本研究通过PmiREN 数据库共获得45个miR828基因家族成员的前体和成熟序列，仅分布在被子植物中。通过WebLogo在线软件对植物miR828家族的成熟序列进行分析，发现仅在第8和第11个碱基处存在碱基多样性，说明miR828序列一致性较高，在植物种间的保守性较强。

通过RNAfold web server在线软件对部分miR828家族成员的pre-miR828二级结构进行预测，结果发现植物miR828家族成员都能形成稳定的茎环结构。植物miRNA通过序列互补的方式与靶基因结合，从而导致靶基因的降解或功能失活。基于该原则，对miRNA靶基因进行预测分析，对深入研究miRNA的功能具有重要指导意义。miR828家族靶基因包括结构域蛋白、转录因子、载体蛋白、泛素连接酶等。多为MYB转录因子及MYB结构域蛋白。这也与前人在拟南芥和番茄中的研究一致，其主要与花青素的合成相关。进化树分析表明了miR828家族成员间的亲缘关系较近。本研究通过生物信息学分析miR828家族成员并预测靶基因，为进一步了解植物miR828家族功能提供基础。

4 结论

(1)miR828分布在被子植物中，其中在数据库中共涉及到25个植物物种。双子叶植物15种，单子叶植物3种，pre-miR828 和成熟miR828数量之间比例关系接近1∶1。

(2)miR828序列在植物进化过程中高度保守，仅在第8和第11个碱基处存在碱基多样性。进化树分析表明，miR828家族成员间的亲缘关系较近。

(3)植物miR828 家族成员前体的二级结构都能形成稳定的茎环结构。

(4)植物miR828家族靶基因包括结构域蛋白、转录因子、载体蛋白、泛素连接酶等，其功能主要与花青素合成相关。