防控温郁金细菌性枯萎病的生物有机肥研制与应用

冯 林，周 铨，陈卫良，毛碧增

(浙江大学 生物技术研究所，农业农村部作物病虫分子生物学重点实验室，浙江省作物病虫生物学重点实验室，浙江 杭州 310058)

温郁金(CurcumawenyujinY.H.Chen et C.Ling)为姜科姜黄属多年生草本植物，位居著名药材“浙八味”之列，主要分布于瓯江流域。浙江省温州市陶山镇是温郁金的道地产区，该地种植温郁金已有千余年的历史[1]。近年来，随着温郁金产业快速发展，种植户长年连作，导致土壤板结、肥力下降等问题，温郁金病害频发，植株大面积死亡。目前报道的病害主要有细菌性枯萎病、叶枯病和根腐病等，其中由茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearun)引起的温郁金细菌性枯萎病最为严重[2]。目前生产上缺乏高抗细菌性枯萎病的品种和有效的病害防治药剂，种植户盲目增肥施药，导致农药残留超标，进而土壤污染加剧，病害加重，严重影响药材产量和品质，制约了温郁金产业的健康发展与经济效益的提高[3-5]。

近年来，在农业农村部启动“减肥减药”行动的号召下，生物有机肥成为研究新热点[6]。生物有机肥不但具有普通有机肥肥效久、营养全、有机质多的特点，而且添加有固氮、溶磷、解钾和抗病等功能的有益微生物，进一步提高其在改善土壤肥料结构、调节作物生长、减缓土传病害等方面的功能[7-9]。本研究对实验室前期筛选到的部分拮抗菌开展茄科劳尔氏菌的拮抗试验，将对温郁金细菌性枯萎病菌具有显著拮抗作用的加米那类芽孢杆菌(PaenibacillusjamilaeZJU-C612-3)和解淀粉芽孢杆菌(BacillusamyloliquefaciensZJU-C612-4)作为功能菌株，以有机肥为载体，制备温郁金生物有机肥，研究其对温郁金细菌性枯萎病的防治效果和对连作障碍的调控情况，以期为温郁金枯萎病的高效防治提供物质基础，为生物有机肥的产业化开发应用提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

温郁金细菌性枯萎病菌(茄科劳尔氏菌)由本实验室前期从温州市陶山镇沙洲村感病温郁金中分离。供试拮抗菌为实验室前期筛选保存的针对不同植物病原菌的8株拮抗菌(没有进行对茄科劳尔氏菌的拮抗测定)。其中，PaenibacillusJamilaZJU-C612-3经鉴定后保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉)，编号为M2019689；BacillusamyloliquefaciensZJU-C612-4经鉴定后保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，武汉)，编号为M2019690。

1.1.2 培养基与试剂

参考黄新琦等[10]方法制备NA培养基、PDA培养基、LB液体培养、TSA培养基；参照张斌等[11]方法配置蛋白培养基、几丁质培养基、葡聚糖培养基、纤维素培养基；参照康贻军等[12]方法配置CAS培养基。试验所用试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司和Sigma-Aldrich公司；16S rDNA基因扩增引物合成和测序委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行。

1.2 方法

1.2.1 拮抗菌的抗菌作用测定

用接种环挑取待测菌株的新鲜单菌落点接到NA平板上，培养24 h后，在培养皿盖上滴1滴氯仿，将培养皿倒置5 min，吸取1 mL过夜培养的温郁金细菌性枯萎病菌的菌悬液(109CFU·mL-1)加入培养皿中，晃匀，倒掉多余的菌悬液，晾干，30 ℃培养24 h后测定抑菌圈的直径，每皿做3个重复。

1.2.2 拮抗菌产酶与代谢物活性测定

为进一步验证筛选到的拮抗菌功能，参考赵文娟等[13]的方法，检测拮抗菌蛋白酶、几丁质酶、β-1，3-葡聚糖酶等活性；参照Ghose[14]的方法检测拮抗菌纤维素酶活性；参照Shin等[15]的方法检测产嗜铁素活性；参照Joachim等[16]和李兴玉等[17]的方法检测脂肽类化合物。

1.2.3 生物有机肥的制备

培养基质的制备：将稻草秸秆、猪粪和白砂糖按质量比100∶50∶3均匀混合。

混合菌液的配制：将PaenibacillusjamilaZJU-C612-3和BacillusamyloliquefaciensZJU-C612-4分别接种到NA培养液中，30 ℃、180 g·min-1恒温振荡培养3 d，所得2株功能菌发酵液按体积比2∶1混合。每t有机肥接种4 L功能菌发酵液，进行固体发酵，并每天翻堆，发酵5～7 d后加工成为颗粒，使生防菌含量高于1×1010CFU·g-1，获得生物有机肥(bio-organic fertilizer，BOF)。生物有机肥的部分指标送农业农村部农产品及加工品质质量安全监督检验测试中心(杭州)进行检测。

1.2.4 生物有机肥的温室盆栽试验

试验在塑料盆(1 m×0.5 m×0.3 m)中进行，每盆装入15 kg基质(基质配方为草木灰∶珍珠岩∶蛭石质量比3∶1∶1，添加1 kg黏土)，添加相应的处理肥料，混合均匀。1盆为1个处理，设置4个处理：处理1，12.5 g复合肥(N 17%,P2O517%,K2O 17%)；处理2，50 g生物有机肥；处理3，125 g生物有机肥；处理4，50 g生物有机肥和12.5 g复合肥(N 17%,P2O517%,K2O 17%)。每个处理设置3个重复。

温郁金组培苗长至3～4叶期时，用无菌剪刀剪去1 cm左右须根，造成伤口，移栽至装有基质的塑料盆中，每盆种植15株，于温室内培养(25 ℃，湿度70%，16 h光照/8 h黑暗)。移栽3 d后，每盆均匀浇灌1 L 1×109CFU·mL-1的茄科劳尔氏菌菌液，移栽15 d后调查发病情况。

1.2.5 生物有机肥的田间防病试验

田间试验在温州市陶山镇沙洲村温郁金种植基地进行，分别以健康根茎和带菌根茎的种源为试验材料，以下列设置的3个处理为基肥：处理1，健康根茎，每667 m2施200 kg生物有机肥；处理2，带菌根茎，每667 m2施200 kg生物有机肥；处理3，健康根茎，每667 m2施50 kg复合肥(N 17%，P2O517%，K2O 17%)，每个处理面积为667 m2，在温郁金生长期统计田间发病率。

1.2.6 生物有机肥对温郁金连作障碍的调控试验

在瑞安市陶山镇七甲村进行，试验田块连续5 a种植温郁金，已出现植株生长发育不良、病虫害加重、产量和品质下降等明显连作障碍现象，总面积约为600 m2。以健康根茎和连作地感病根茎作为供试材料，以下列4个处理的肥料为基肥，每个处理面积为50 m2，3次重复。处理1：健康根茎，施复合肥7.5 kg；处理2：感病根茎，施复合肥7.5 kg；处理3：健康根茎，施生物有机肥50 kg+复合肥3 kg；处理4：感病根茎，施生物有机肥50 kg+复合肥3 kg。其中，复合肥的氮磷钾比例为17-17-17。调查温郁金生长期的田间发病率，并对温郁金姜黄产量进行测定。

1.3 数据统计与分析

试验数据处理使用Origin 9.0和SPSS 20.0等统计分析软件，图表制作采用Office 2016软件，图片处理采用Photoshop CC软件，数据采用邓肯多重检验(Duncan’s Multiple Range Test，DMRT，P<0.05)方法进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌对茄科劳尔氏菌的拮抗活性

选取实验室前期保存的8株拮抗菌，测定它们对茄科劳尔氏菌的拮抗活性。结果(图1)表明，8株菌株对茄科劳尔氏菌都具有抑菌效果，抑菌圈直径为5.2～21.7 mm，其中P.jamilaZJU-C612-3和B.amyloliquefaciensZJU-C612-4抑菌效果最好，抑菌圈直径分别为19.3 mm和21.7 mm，因此选择这2株菌作为后续试验和制备生物有机肥的菌株。

柱上无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 拮抗菌产酶与代谢物活性

前期实验室已完成菌株鉴定，为进一步探究拮抗菌的生理活性，作为后续制备生物有机肥依据，对2株拮抗菌的产酶和代谢产物活性进行检测，发现P.jamilaZJU-C612-3中产蛋白酶和纤维素酶活性较弱，能产生较多嗜铁素，无几丁质酶和葡聚糖酶活性(图2)；能产生多种杀镰孢菌素(fusaricidins)和多黏菌素(polymyxin)，且杀镰孢菌素含量明显高于多黏菌素，表明该细菌具有良好的拮抗活性(表1)。

表1 类芽孢杆菌ZJU-C612-3杀镰孢菌素和多粘菌素检测结果

B.amyloliquefaciensZJU-C612-4产蛋白酶活性高，无几丁质酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶活性，不能产生嗜铁素(图2)；产丰富的脂肽类化合物且含有大量的同分异构体，包括杆菌霉素、丰源素和表面活性素3类，其中，伊枯草素的出峰值最高，产量明显高于其他2种脂肽类(表2)。

表2 解淀粉芽孢杆菌ZJU-C612-4环脂肽类物质检测结果

+为培养基正面，-为培养基反面。

2.3 生物有机肥品质鉴定

以稻草秸秆、猪粪和白砂糖为载体，以P.jamilaeZJU-C612-3和BamyloliquefaciensZJU-C612-4为功能菌株制备的BOF颗粒均匀，无异味，无机械杂质。相关指标检测结果(表3)表明，制备的生物有机肥符合国家相关肥料标准。

表3 生物有机肥的成分指标分析

2.4 生物有机肥温室盆栽防病效果

将温郁金组培苗移栽到塑料盆15 d后调查发病情况，结果(表4)显示，对照组，即处理1(施12.5 g复合肥)的温郁金全部死亡，发病率为100%；处理3(施125 g生物有机肥，折算田间用量为每667 m2施500 kg)的发病率最低，为40.00%。处理2(施50 g生物有机肥，折算田间用量为每667 m2施200 kg)与处理4(施50 g生物有机肥和12.5 g复合肥)发病率没有显著差异。

表4 生物有机肥对温郁金发病率的影响盆栽试验

2.5 生物有机肥田间防病效果

生物有机肥对温郁金的田间防病效果见图3。没有施生物有机肥的处理3(健康根茎+复合肥50 kg)发病率最高(发病率23.33%)；施生物有机肥后，不论是选用健康根茎，还是带菌根茎，其发病率均显著降低，其中处理1发病率为5.67%，处理2发病率为6.67%。调查中还发现，施生物有机肥的健康根茎(处理1)植株健壮，叶片多、大、肥厚，叶色深绿，长势优于施生物有机肥的带病根茎(处理2)和没有施生物有机肥的健康根茎(处理3)。此结果表明，田间施生物有机肥具有防病促生的效果。

2.6 生物有机肥调控田间连作障碍效果

为验证生物有机肥是否对温郁金连作障碍具有缓解作用，在温州市陶山镇七甲村开展田间试验。分别于2021年7月30日和8月30日对连作田块温郁金发病率进行调查。结果(图4)显示，7月和8月，处理3(常规根茎，施生物有机肥)温郁金的发病率最低(分别为4.69%和7.62%)，而处理2(连作根茎，施复合肥)温郁金的发病率最高(分别为20.44%和45.30%)，处理1(常规根茎，施复合肥)温郁金的发病率为5.24%和15.96%，处理4(连作根茎，施生物有机肥)温郁金的发病率为11.01%和25.55%。对同用常规根茎处理组进行比较，7月和8月，处理3(施生物有机肥)温郁金的发病率比处理1(施复合肥)分别下降了0.55百分点和8.34百分点；对同用连作根茎处理组进行比较，7月和8月施生物有机肥的处理4比施复合肥的处理2的发病率分别下降了9.43百分点和19.75百分点。由此可见，施生物有机肥可以减缓连作田中温郁金的发病率，对连作障碍调控有显著作用。田间发病情况见图5。

处理1，常规根茎+复合肥；处理2，连作根茎+复合肥；处理3，常规根茎+BOF；处理4，连作根茎+BOF。

A，常规根茎+复合肥；B，连作根茎+复合肥；C，常规根茎+BOF；D，连作根茎+BOF。

12月28日对连作田间温郁金进行测产，由于连作田块中郁金产量较低，因此，以姜黄、莪术产量进行统计分析。结果(表5)显示，处理3(常规根茎，施生物有机肥)的温郁金单株产量最高，达到(1.16±0.41)kg，比产量最低的处理2(连作根茎，施复合肥)增产213.51%，比处理1(常规根茎，施复合肥)增产93.33%，比处理4(连作根茎，施生物有机肥)增产63.38%。此外，同是连作根茎，施生物有机肥的处理4比施复合肥的处理2单株增产91.90%。由此可知，施生物有机肥具有缓解温郁金连作障碍、提高产量的作用。

表5 连作田间有机肥试验测产结果

3 结论与讨论

P.jamilaeZJU-C612-3和B.amyloliquefaciensZJU-C612-4对温郁金细菌性枯萎病病原菌具有显著拮抗效果，以这2株拮抗菌为基础制备的生物有机肥品质符合国家相关标准。温室和田间试验表明，研制的生物有机肥能有效降低温郁金细菌性枯萎病的发病率，对温郁金的连作障碍有较好的缓解作用，并能显著提高姜黄和莪术的产量。在温室条件下，每667 m2施500 kg生物有机肥的防病效果优于每667 m2施200 kg生物有机肥；田间试验表明，每667 m2施200 kg生物有机肥就可达到较好的效果，这可能是由于人工接种的病原菌浓度较高，加上温室条件稳定，加剧发病情况，因此需要施更多的生物有机肥来提高对病害的防控能力。当然，生物有机肥对温郁金病害的防控能力受土壤肥力水平、土壤和种茎的带菌状况、肥水和栽培管理等多种因素的影响，在今后的应用中需要根据实际情况调整生物有机肥的用量。

类芽孢杆菌在自然环境中栖息广泛，在植物根际生长旺盛，具有固氮功能和广谱的抗菌活性[18]。芽孢杆菌产生的抗生素结构多样，具有两性生物分子特性，且理化性质稳定，对革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、酵母、丝状真菌均有强烈的抑制作用[19]。解淀粉芽胞杆菌是茄科劳尔氏菌的一种重要生防资源，该菌基因组中有约7.5%的基因被用于合成次生代谢产物，包括CLPs抗生素和聚酮类[20]。本研究使用的P.jamilaeZJU-C612-3和B.amyloliquefaciensZJU-C612-4均能分泌多种物质，它们在产酶和代谢物活性方面存在差异，因此将二菌株混合能实现功能互补，能更好地完善生物有机肥在抑制病原菌、促进植物生长等方面的功能。

滥用化学肥料可使土壤结构遭到破坏，微生物群落受到威胁，有益微生物锐减，营养物质大量流失，土壤肥力下降，土传病害积累，自净能力减弱，直接影响植株的品质和产量。由茄科劳尔氏菌引起的细菌性枯萎病是一种世界范围的毁灭性病害，茄科劳尔氏菌是一种土传的细菌性维管束病害[21]，它可侵染烟草根、茎、叶等多个组织[22]，该病原菌具有广泛的寄主范围和地理分布，给作物生产造成经济损失。温郁金细菌性枯萎病由茄科劳尔氏菌引起，地势低洼积水等田间环境和潮湿高温等气候条件都会加剧病害的发生和传播。针对该病害，王连平等[6]研究发现，乙蒜素、链·土霉素具有较好的防控效果，但因其方案实际操作复杂，未能在生产中广泛推广，目前种植户仍以施用传统药肥为主要防治手段。而生物有机肥可以促进植物生长，诱导植物产生系统抗性[23]。Oostendorp等[24]研究表明，生物或非生物因子都可诱导植物产生系统抗性，提高植物体内过氧化物酶、超氧化物歧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性。此外，生物有机肥中的功能菌，部分菌株除能直接对病原菌有拮抗作用外，还能改善根际土壤中的微生物群落结构，富集更多的有益菌，使植物根际微环境更健康。本研究利用对温郁金细菌性枯萎病菌有直接拮抗活性的2株细菌菌株制备生物有机肥，该生物有机肥能够有效降低温郁金细菌性枯萎病的发病率，并且具有减缓温郁金连作障碍、提高温郁金品质和产量的功能，显示出较好的应用前景。