不同贮藏年限对莼菜种子保护酶活性及种子活力的影响

王凯飚，王先龙，王博文，向如意，王明红

（湖北民族大学林学园艺学院，湖北恩施 445000）

莼菜（Brasenia schreberi）作为名、特、稀、优的野生水生蔬菜[1]，是国家二级保护野生植物[2]，主要生长在湖泊、沼泽、池塘等淡水湿地中[3]，莼菜还是休闲观光农业中独具特色的观赏蔬菜，是我国传统园林绿化植物配置中常用的植物素材[4-5]。为保持品种的优良性状，且莼菜种子发芽率低，因此莼菜栽培以茎段扦插的无性繁殖为主，具有繁殖周期短、速度快和数量大等优点，但长期无性繁殖会导致品质下降和产量降低等[6-7]，需提纯复壮。莼菜在自然状态下可以开花结籽，利用其种子开展育种研究对于保护种质资源、保持遗传多样性[8]具有重要作用。但目前有关莼菜种子的研究较少，主要集中于莼菜的栽培技术方面[9-10]。覃章辉[11]解析了莼菜种子休眠的原因，并研究了光照、温度处理对莼菜冬芽休眠解除的影响，但贮藏年限对种子活力的影响尚无研究。有作者分别研究了贮藏年限对苜蓿[12]、燕麦[13]、烟草[14]、沙芥属[15]种子萌发和生理特性的影响，均发现贮藏年限对作物种子发芽影响较大，且不同作物贮藏年限差异也较大，因此，为探寻莼菜种子最佳的贮藏年限，本研究以莼菜种子为材料，比较了不同贮藏年限下莼菜种子抗氧化酶活性和发芽指标的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

选用2018（贮藏4 年）、2019（贮藏3 年）、2020（贮藏2 年）、2022（贮藏0 年）（2021 年种子受新冠肺炎疫情影响未采集）采集的莼菜种子为材料，试验种子均采自湖北省利川市凉雾乡继昌莼菜基地。采后待种荚腐烂，经人工剥离种皮，消毒处理后，于4℃低温保存。随机选取种皮完整且无污染的不同年限种子各300 粒，备用。

1.2 测定项目及方法

1.2.1 丙二醛含量和保护酶活性测定。选取不同贮藏年限种子各200 粒，用75%酒精浸泡消毒5min 后，用自来水反复冲洗，再用纯水冲洗3～5 遍，用滤纸将种子表面水分吸干后，置于研钵中研磨成粉末，称取约0.1g 样品，各重复3 次，用于测定丙二醛含量和保护酶活性，其中，MDA 采用硫代巴比妥酸法[16]，SOD、POD、CAT 采用分光光度法[17-19]，具体提取和测定步骤按照苏州科铭生物有限公司试剂盒内说明书进行。

1.2.2 测定种子发芽指标。选取贮藏不同年限的莼菜种子各100 粒，用75%酒精浸泡消毒5min 后，用自来水反复冲洗，再用纯水冲洗3～5 遍，用滤纸吸干水分后，种子置于铺有双层湿滤纸的培养皿（9mm）中，每个处理4 皿，每皿25 粒种子，用纯水浸透滤纸萌发，于25℃下培养。每天观察发芽情况，适当补充纯水，以种子胚根长度达到种子长度视为发芽，统计并计算发芽势、发芽率[20]，公式如下。

发芽率（%）=（最终种子发芽数／供试种子数）×100

发芽势（%）=（发芽种子数达到高峰时正常发芽种子总数／供试种子数）×100

发芽指数=∑Gt／Dt

式中：Gt 为第t 天发芽种子数，Dt 为发芽天数。

1.3 数据处理

试验结果采用EXCEL 2013 进行数据统计，GraphPad Prism 5 和SPSS 20.2 作图和分析。

2 结果与分析

2.1 贮藏年限对莼菜种子中丙二醛含量及抗氧化酶活性的影响

2.1.1 对丙二醛含量的影响。在相同贮藏条件下，莼菜种子MDA 含量随着贮藏年限的延长呈现明显上升趋势（见图1）。其中收获当年的莼菜种子（贮藏0 年）MDA含量显著低于其他各贮藏年限（P＜0.5）；贮藏2 年和贮藏3 年的种子MDA 含量无显著差异；贮藏4 年的种子MDA 含量显著高于其他贮藏年限，分别比贮藏0 年、2年、3 年的高31.8%、21%和15.4%。

图1 不同贮藏年限莼菜种子MDA 含量变化

2.1.2 对抗氧化酶活性的影响。①SOD 活性。在相同贮藏条件下，莼菜种子中SOD 活性随着贮藏时间的延长呈显著降低的变化趋势，平均每年下降36.03%；其中，收获当年的莼菜种子（即贮藏0 年）SOD 活性显著强于其他贮藏年限（P＜0.05）（见图2）。②POD 活性。在相同贮藏条件下，莼菜种子中POD 活性随着贮藏时间的延长呈现出先升后降的变化趋势，其中贮藏2 年的活性最强，显著强于其他贮藏年限（P＜0.05）（见图3），分别较贮藏0、3、4 年的提高36.6%、69.2%和59.6%。③CAT 活性。在相同贮藏条件下，莼菜种子CAT 活性随贮藏年限延逐渐增强，其中贮藏4 年时活性最强，显著强于其他贮藏年限（P＜0.5）（见图4），分别较贮藏0、2、3 年的提高84.5%、41.5%和27.6%。

图2 不同贮藏年限莼菜种子SOD 活性变化

图3 不同贮藏年限莼菜种子POD 活性变化

图4 不同贮藏年限莼菜种子CAT 活性变化

2.2 贮藏年限对莼菜种子萌发特性的影响

由表1 可知，在相同贮藏条件下，随着贮藏年限延长，莼菜种子发芽率、发芽势和发芽指数均呈先增加、后降低的趋势，其中贮藏2 年的发芽率最高，显著高于贮藏0、4 年的种子（P＜0.05），与贮藏3 年的种子无显著差异；发芽势和发芽指数最大，显著大于其他贮藏年限的种子（P＜0.05）。其次是贮藏3 年的种子，贮藏0 年的种子各指标显著低于其他贮藏年限。

表1 不同贮藏年限对种子发芽率、发芽势和发芽指数的影响

2.3 种子萌发指标与生理指标的相关性分析

由表2 可知，各发芽指标间相关性达极显著水平。MDA 含量及CAT 活性与各发芽指标呈负相关，其中MDA 含量与发芽势和发芽指数相关性达显著水平；CAT 活性与发芽率相关性达显著水平，与发芽势和发芽指数相关性达极显著水平；POD 活性与发芽率呈负相关，与发芽势和发芽指数呈正相关，但相关性均未达显著水平；SOD 活性与各发芽指标呈正相关，其中与发芽率相关性达显著水平，与发芽势相关性达极显著水平。CAT 活性与MDA 含量呈极显著正相关，POD、SOD活性与MDA 含量均呈负相关，其中SOD 与MDA 含量相关性达极显著水平。

表2 不同贮藏年份的种子活力与生理指标的Pearson 相关性分析

3 讨论

本研究比较了不同贮藏年限对莼菜种子发芽指标的影响，结果表明，贮藏2 年的莼菜种子发芽率、发芽势和发芽指数均最好，贮藏0 年即当年采收的种子发芽指标均最差，贮藏3、4 年的种子发芽指标均显著下降。陈新军等[21]研究了贮藏时间和温度对甘蓝型油菜种子活力及脂肪酸含量的影响，结果发现，油菜种子随贮藏年限的增加发芽率和发芽势下降；杨忠仁等[22]研究结果表明，贮藏1～3 年的沙葱种子发芽率和发芽势呈升高趋势，贮藏4～10 年的种子发芽率和发芽势逐渐降低；刘玉兰等[23]研究发现低温（5℃）贮藏条件下，3 个小粒豆品种安全贮藏期不同，有的为1 年，有的为2 年。说明贮藏年限对种子的发芽率、发芽势和发芽指数均有一定影响，但变化趋势存在差异，与蔬菜种类和品种有关，且不同蔬菜贮藏最佳年限存在差异，本研究中的莼菜种子在4℃低温条件下贮藏，其最适年限为2 年，且不宜采用当年采收的种子，可能是因为当年采收的莼菜种子未脱离休眠期，亦或种子内源抑制物质含量较高，但其内源抑制物质含量种类和高低等尚不明确[24]，以及是否可以采用物理或化学方法打破种子休眠以提高新采收种子的发芽率等还需进一步研究；而贮藏时间超过2 年后，种子活力下降，可能与长期的呼吸作用消耗了种子内储存的营养物质以及种子酶活性降低有关。种子发芽率除与本身特性有关外，还受贮藏条件、催芽方法等影响，如郝树芹等[25]发现，60 kHz 超声波处理一定时间可延缓贮藏种子发芽率降低的趋势；郑国太[26]发现，变成层积催芽处理有助于提高山樱花种子发芽率，因此后续可开展相关提高莼菜种子发芽率的试验研究。

MDA 是细胞膜脂过氧化的产物，其含量高低反映膜脂过氧化程度的强弱和毒害程度[27]，因此可作为种子在逆境胁迫下的重要评价指标[28]；而CAT、POD、SOD 是植物细胞内抗氧化系统的3 种重要保护酶，SOD 为抗氧化酶系统中的第一道防线[29]，可将O2-通过歧化作用转化成H2O2，而CAT 和POD 可将H2O2分解成O2和H2O[30-31]，三者协同作用，清除细胞内的超氧阴离子自由基和过氧化氢等，保护生物膜系统免受损伤[32]。本研究中，莼菜种子MDA 含量随贮藏年限延长呈上升趋势，贮藏4 年的种子MDA 含量最高，表明其膜脂过氧化程度最严重，贮藏2 年和3 年的种子MDA 含量相差不大；而SOD 活性变化趋势与MDA 相反，贮藏4 年的种子SOD 活性最弱，侧面反映随着贮藏年限的增加，种子活力减弱；CAT 活性变化趋势与MDA 一致，说明为清除其体内过多的过氧化物，种子通过增强抗氧化系统中CAT 活性，以避免种子老化程度加剧；POD 活性变化趋势与其他酶不同，贮藏2 年的种子POD 活性最强，显著强于其他贮藏年限，说明POD 在种子抗氧化老化过程中发挥了重要作用，是清除H2O2的关键酶，但贮藏3 年和4 年后种子内的POD 酶活性减弱，不足以清除种子老化和劣变导致的MDA，因此贮藏年限超过2 年后，时间越长，种子活力越弱，发芽指数降低。刘逸童等[33]发现低温和常温贮藏下，随贮藏时间延长，各品种水稻的MDA 含量逐渐升高，而SOD、POD、CAT 活性逐渐下降；徐宁伟等[34]研究自然贮藏时间对叶底珠种子保护酶活性及种子活力的影响，发现SOD 活性先升后降、POD 和MDA 含量逐渐升高，CAT 活性逐年下降，与本研究结果略有不同。由此可见，不同贮藏年限对种子内抗氧化酶活性的影响比较复杂，因受贮藏环境和种间差异的制约有所不同。

为进一步研究各指标间的关系，进行了指标间的相关性分析，结果显示MDA 含量与种子的发芽势和发芽指数显著负相关，说明可通过测定MDA 含量判定种子活力；CAT 活性与MDA 含量极显著正相关，说明CAT对清除种子体内MDA 具有重要作用；SOD 活性与MDA 含量极显著负相关，说明SOD 活性高低也可用于评价莼菜种子活力。

4 结论

在低温贮藏条件下，莼菜种子最佳贮藏年限为2年。在实际生产过程中，利用种子进行莼菜的繁育，不建议使用贮藏2 年以上的种子；因2 年后种子劣变程度增加，其种用价值降低。