冷冻快速免疫组化试剂在石蜡组织切片中的应用

陈 刚，宋国新，韩 雪，张炜明

常规石蜡组织免疫组化染色定位清晰，具有特异性和敏感性，是病理诊断中重要的辅助检查，但抗体孵育时间较长，染色流程平均需2.5～3 h。冷冻快速免疫组化染色应用超敏感抗体标记技术，具有特异性、敏感性、操作简便、用时短的特点，但冷冻组织形态结构不如石蜡组织清晰，限制了其在临床中的应用。笔者将冷冻快速免疫组化抗体应用于常规石蜡切片免疫组化染色，取得了较好的染色效果，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料选取2021～2022年南京医科大学第一附属医院存档的肺癌蜡块标本10例，其中肺鳞状细胞癌、肺腺癌各5例。

1.2 试剂快速免疫组化一步法专用酶标聚合物一抗CK5/6、p63、CKpan、TTF-1，均购自美鑫达医疗公司。快速免疫组化两步法专用一抗CK5/6、p63、CKpan、TTF-1，专用酶标聚合物二抗，均购自赛诺特生物公司。柠檬酸抗原修复液(pH 6.0)，常规免疫组化一抗CK5/6、p63、CKpan、TTF-1，鼠兔通用型MaxVision二抗，DAB显色试剂盒，均购自福州迈新公司。

1.3 方法肺鳞状细胞癌蜡块每例连续3 μm厚切片9张，肺腺癌蜡块每例连续3 μm厚切片3张，65 ℃烤片30 min，常规脱蜡至水，所有切片均经柠檬酸抗原修复液(pH 6.0)高压热修复12 min后分为3组：A实验组采用快速免疫组化一步法，B实验组采用快速免疫组化两步法，标准对照组采用常规免疫组化两步法，分别对肺癌石蜡切片中肿瘤细胞标志物CK5/6、p63、CKpan、TTF-1进行染色。具体操作步骤：(1)A实验组：加冷冻快速专用一抗，室温孵育3 min，PBS冲洗3次×1 min，DAB显色3 min。(2)B实验组：加冷冻快速专用鼠源性一抗，室温孵育4 min，PBS冲洗3次×1 min，加专用酶标抗鼠聚合物二抗室温孵育3 min，PBS冲洗3次×1 min，DAB显色3 min。(3)标准对照组：加常规福州迈新公司一抗37 ℃孵育1 h，PBS冲洗3次×1 min，加鼠兔通用型MaxVision二抗室温孵育20 min，PBS冲洗3次×1 min，DAB显色5 min。显色完成后三组切片均经苏木精复染，常规封固，镜检。

2 结果

2.1 染色质量对比采用快速免疫组化一步法(A实验组)、两步法(B实验组)，分别对肺鳞状细胞癌石蜡切片中CK5/6、p63、CKpan和肺腺癌石蜡切片中TTF-1进行染色。结果显示：两种检测方法均定位准确，背景清晰，染色强度适中(图1、2)。A、B实验组染色质量与标准对照组(图3)相比，差异无显著性。

2.2 染色时间对比三组实验分别记录免疫组化染色时间，包括一、二抗孵育、PBS冲洗、DAB显色时间。本实验中快速免疫组化一步法(A实验组)用时最短，染色总时间仅需9 min；快速免疫组化两步法(B实验组)用时稍长，染色时间需16 min。A、B实验组染色时间均明显低于标准对照组(表1)。

表1 各组染色时间对比分析

3 讨论

石蜡组织切片是常规免疫组化染色首选的标本类型[1]，其具有细胞形态结构好，染色定位清晰，反应敏感且特异等特点。免疫组化技术根据酶标记位置可分为直接法和间接法。直接法是将酶标记在一抗上，操作简便，特异性强，但因抗体只能结合有限的酶分子，敏感性较低，且每种特异性抗体均需标记，制作成本高。间接法是将酶标记于二抗上，在特异性一抗与组织中的抗原反应后，再用酶标二抗与一抗结合后显色，由于二抗对一抗的多点识别模式，其染色敏感性更高，通用性更强。随着酶标聚合物技术的发展，现行石蜡组织常规免疫组化染色大多采用间接法[2]，为了能达到良好的染色效果，一、二抗孵育时间长，各类主流全自动免疫组化染色仪实际染色全流程平均需用时2.5 h以上。

①A①B②A②B③A③B

冷冻快速免疫组化法与常规免疫组化法相比，其抗体浓度高且纯[3]，既减少抗体的孵育时间，也保证染色的特异性。在本实验中，A实验组(直接法)运用独特的抗体纳米超敏感多聚体直接偶联标记技术，将辣根过氧化物酶多聚体直接标记一抗，不仅简化操作步骤，更有效提高染色敏感性，整个染色流程仅需9 min即可达到良好的染色效果。B实验组(间接法)二抗采用独特的微聚合物层叠技术，将二抗F(ab′)2片段和酶通过新型偶联化学在微骨架上分层有序聚合，提升了特异性和敏感度，总染色时间也仅需16 min就能取得和标准法相同的染色效果。与常规免疫组化法相比，两种快速免疫组化法在染色时长上优势明显，本实验4种抗体染色定位准确，背景清晰，强度适中，与常规标准对照法差异无显著性。综上所述，本实验将冷冻快速免疫组化试剂应用于石蜡组织切片可缩短染色时间，提高病理诊断的及时率，减少患者报告等待时间。

由于抗体制备成本高、种类少等原因，冷冻快速免疫组化试剂尚不能广泛应用于石蜡切片的快速免疫组化染色。随着抗体制备成本的降低以及超敏酶标技术的发展，快速石蜡组织免疫组化有望成为未来免疫组化的发展方向。