探讨骨肉瘤化疗耐药中FoxM1与c-myc的关系及其作用机制

尹诗源，李雨晴，尹 玉，蔡永萍,2

骨肉瘤是一种高度恶性的骨原发性恶性肿瘤，好发于青少年。自20世纪70年代采用术前新辅助化疗后，患者5年生存率从不足20%提升到60%～75%，但新辅助化疗耐药患者的预后仍较差，不足20%[1]。在过去的几十年里，研究者虽然进行不断地探索，但多项临床实验显示改变化疗药物剂量或联合使用新药均未能明显改善患者的预后[2]。目前，骨肉瘤患者的生存率停滞不前，化疗耐药是制约治疗进展的重要难题。本课题组前期研究发现，叉头框蛋白M1(forkhead box M1, FoxM1)与骨肉瘤细胞的增殖、迁移及化疗耐药相关[3-4]，但具体机制尚不清楚。最新一项研究[5]分析3个不同队列的258例高级别骨肉瘤基因拷贝数读数，发现c-myc显著富集；同时，Fu等[6]进一步研究发现c-myc在骨肉瘤转移组中比非转移组表达明显增高。骨肉瘤新辅助化疗耐药患者常出现转移、预后差，但c-myc高表达是否与骨肉瘤化疗耐药有关尚不清楚。因此，本文重点探讨c-myc与骨肉瘤化疗耐药的关系及是否受FoxM1的调控，其有望为临床骨肉瘤化疗耐药寻找新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 试剂骨肉瘤细胞系HOS和U2OS购自中科院上海细胞库。FoxM1抗体(ab207298)和c-myc抗体(ab32072)购自Abcam公司；RCM-1(CAS 339163-65-4)购自Sigma公司；顺铂购自南京制药公司。

1.2 细胞培养细胞在含10%灭活胎牛血清的DMEM培养液中培养，2～3天/次弃旧液，0.25%胰蛋白酶消化传代继续培养。课题组前期建立的HOS和U2OS顺铂耐药细胞系在含2 μg/mL顺铂培养液里稳定生长和传代，分别命名为HOS/R和U2OS/R。

1.3 慢病毒转染建立稳定过表达FoxM1骨肉瘤细胞FoxM1克隆引物序列如下。FoxM1正向：5′-GCTAGCATCGATACGCGTAAAACTAGCCCCCGTCGG-3′；FoxM1反向：5′-TGCGGATCCTTCGAACTAGTC TACTGTAGCTCAGGAATAAACTGGG-3′。对FoxM1扩增产物经测序验证。过表达质粒载体为pSIN-EF2-HA-Puro，使用SpeI和MluI两种限制性核酸内切酶，通过同源重组的方式将目的基因连接到载体上。配置750 μL opti-MEM、12 μg目的质粒(空载体或FoxM1)、6 μg pCAG-dR8.9、1.5 μg VSVG和750 μL opti-MEM的混合物，混合后室温静置20 min，将其轻柔地滴加入293T细胞培养液中，培养6 h后更换培养基，隔天获得293T的培养基病毒上清，并使用0.22 μm的滤器过滤。在细胞贴壁密度约70%时，加入8 μg/μL polybrene的病毒，6～8 h后补液至8 mL，待48 h后重新消化传代，同时进行1 μg/mL嘌呤霉素感染细胞，进行传代培养。

1.4 Western blot法收集细胞后加入裂解液，提取总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后5%脱脂牛奶封闭1 h以上，再加入一抗FoxM1(1 ∶1 000稀释)、c-myc(1 ∶1 000稀释)或GAPDH(1 ∶5 000稀释)4 ℃孵育过夜，加入HRP标记的兔二抗(1 ∶10 000稀释)室温孵育2 h，显影。

1.5 CCK-8细胞增殖实验将处于对数生长期的骨肉瘤贴壁细胞取100 μL(每毫升5×104个细胞)分别接种于96孔板。培养24 h后弃去培养液，分别加入DMSO或10 μmol/L RCM-1和2 μg/mL顺铂。第1～4天，每孔中加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃保存2 h后弃去液体，450 nm处测定吸光度。

1.6 生物信息分析c-myc与FoxM1的Kaplan-Meier生存曲线图来自GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)数据库。

2 结果

2.1 骨肉瘤耐药细胞中FoxM1和c-myc的表达本课题组前期已建立稳定骨肉瘤顺铂耐药细胞HOS/R和U2OS/R，在2 μg/mL顺铂中均稳定生长。运用Western blot法检测FoxM1和c-myc的蛋白表达水平。结果显示：与亲本细胞相比(HOS：0.38±0.06，U2OS：0.32±0.02)，骨肉瘤耐药细胞中FoxM1(HOS/R：0.69±0.06，U2OS/R：0.88±0.01)的蛋白表达水平升高(图1A)，c-myc在骨肉瘤耐药细胞中的表达也升高(图1B)，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 Western blot法检测骨肉瘤亲本细胞HOS、U2OS和顺铂耐药细胞HOS/R、U2OS/R细胞中FoxM1(A)、c-myc(B)的蛋白表达：*P<0.05，**P<0.01

2.2 FoxM1与c-myc表达的关系运用慢病毒载体构建稳定过表达FoxM1的骨肉瘤细胞HOS/FoxM1和U2OS/FoxM1。Western blot检测显示：与对照组相比，HOS/FoxM1和U2OS/FoxM1中FoxM1的蛋白表达水平升高(P<0.05, 图2A)，表明成功构建稳定过表达FoxM1骨肉瘤细胞；与对照组HOS/NC(0.35±0.07)和U2OS/NC(0.59±0.03)相比，HOS/FoxM1(1.19±0.08)和U2OS/FoxM1(1.61±0.13)中的c-myc蛋白表达升高(图2B)，差异均有统计学意义(P<0.05)，表明c-myc的表达受FoxM1调控。

图2 Western blot法检测空载体对照HOS/NC、U2OS/NC和FoxM1稳定过表达细胞HOS/FoxM1、U2OS/FoxM1细胞中FoxM1(A)、c-myc(B)蛋白表达水平:*P<0.05，**P<0.01

2.3 FoxM1抑制剂RCM-1对FoxM1、c-myc表达的影响在耐药细胞和过表达FoxM1细胞中加入10 μmol/L RCM-1处理48 h后检测蛋白表达。Western blot结果显示：与对照DMSO组相比，10 μmol/L RCM-1处理耐药细胞后，FoxM1和c-myc蛋白表达量显著下降(P<0.01,图3A)。同样，经10 μmol/L RCM-1处理过表达FoxM1细胞(FoxM1：0.11±0.03vs0.10±0.02，c-myc：0.35±0.01vs0.36±0.02)，FoxM1和c-myc蛋白表达比对照DMSO组(FoxM1：0.78±0.02vs1.11±0.10，c-myc：0.93±0.04vs0.82±0.02)也显著降低(P<0.01,图3B)。以上实验结果表明：抑制FoxM1表达后c-myc表达下降，提示c-myc表达受FoxM1的调控。

图3 在耐药细胞HOS/R、U2OS/R(A)和FoxM1过表达细胞HOS/FoxM1、U2OS/FoxM1(B)中FoxM1及c-myc的蛋白水平表达：DMSO.对照组，**P<0.01

2.4 FoxM1抑制剂RCM-1对骨肉瘤细胞顺铂化疗敏感性的影响为了探讨抑制FoxM1对骨肉瘤化疗敏感性的影响，在骨肉瘤耐药细胞和FoxM1过表达细胞中分别给予2 μg/mL顺铂+DMSO或2 μg/mL顺铂+10 μmol/L RCM-1。结果显示：在骨肉瘤耐药细胞中，联合RCM-1和顺铂(HOS/R：0.22±0.07, U2OS/R：0.25±0.03)处理与单独顺铂(HOS/R：0.64±0.04, U2OS/R：0.70±0.11)给药组相比，细胞增殖能力明显降低(图4A、B)，在FoxM1过表达细胞组联合RCM-1和顺铂(HOS/FoxM1：0.23±0.03，U2OS/FoxM1：0.26±0.04)与单独顺铂给药组(HOS/FoxM1：0.61±0.03，U2OS/FoxM1：0.65±0.05)相比细胞增殖能力也明显降低(图4C、D)，差异均有统计学意义(P<0.05)。以上实验结果表明，联合使用FoxM1抑制剂RCM-1，可以增加耐药骨肉瘤细胞对化疗药物敏感性。

图4 CCK-8细胞增殖实验：分别给予DMSO+顺铂(2 μg/mL)或RCM-1(10 μmol/L)+顺铂(2 μg/mL)后，HOS/R(A)、U2OS/R(B)、HOS/ FoxM1(C)和U2OS/ FoxM1(D)细胞增殖曲线：*P<0.05，**P<0.01

2.5 FoxM1和c-myc高表达与患者预后的关系GEPIA数据库数据中FoxM1与c-myc的Kaplan-Meier生存曲线分析显示，FoxM1和c-myc高表达组和低表达组总生存期差异均有统计学意义，高表达组患者预后差(P<0.05，图5)。

图5 GEPIA数据库显示FoxM1(A)和c-myc(B)表达与患者总生存期的关系：P<0.05

3 讨论

骨肉瘤是最常见的高度恶性骨原发性肿瘤，约占肉瘤的30%，好发于青少年[7]。自20世纪70年代，采用阿霉素、顺铂联合甲氨蝶呤的新辅助化疗使骨肉瘤患者的生存率大幅提升[2]。新辅助化疗后，在瘤体切除标本中评估肿瘤坏死率，分为反应好者(>90%肿瘤细胞坏死)和反应差者(<90%肿瘤细胞坏死)，研究发现在多变量Cox模型中，对化疗反应好者的无瘤生存率和总生存率均较高，而化疗反应差者预后较差[8]。因此，探索骨肉瘤化疗耐药机制，寻找新的治疗靶点是骨肉瘤临床治疗的难题。

骨肉瘤是一种具有广泛组织异质性、基因组高度不稳定性的恶性肿瘤，化疗耐药机制非常复杂。目前，研究发现耐药可能与药物在细胞内蓄积、药物失活、DNA损伤修复、肿瘤微环境等多种因素有关[2]。很多临床试验尝试在传统化疗药物基础上联合使用新的药物，如在一线化疗方案中添加异环磷酰胺或依托泊苷，这些试验结果显示增加新的药物非但未改善患者预后，还带来与治疗相关的严重毒性[1,9]。因此，深入分析骨肉瘤化疗耐药分子机制，对改善骨肉瘤的治疗意义重大。

FoxM1最初被认为是一种细胞增殖相关转录因子，后来发现其在细胞分化、干细胞自我更新及肿瘤发生等多种生理或者病理过程中发挥重要作用[10-11]。近年研究发现FoxM1也参与化疗药物的耐药[10,12]。本组发现FoxM1在骨肉瘤顺铂耐药细胞中的表达比亲本细胞明显升高，FoxM1过表达细胞表现出对顺铂药物的耐药性增加。本组前期实验也发现，FoxM1高表达与骨肉瘤细胞增殖、侵袭相关[3]，FoxM1高表达促进肿瘤干细胞特性表达[13]、DNA损伤修复增强[14]，且FoxM1高表达骨肉瘤患者的临床预后更差[4]，提示FoxM1高表达可能与骨肉瘤化疗耐药密切相关。文献报道FoxM1与三阴型乳腺癌的紫杉醇化疗耐药相关，联合FoxM1抑制剂和紫杉醇治疗可增加耐药细胞的敏感性[15]。近年，研究提示FoxM1可能作为临床化疗耐药治疗的潜在靶点[12,16]，但其信号通路中存在众多调控因子和效应因子，具体调控机制仍不清楚。

c-myc是肿瘤中常见的活化原癌基因之一，与细胞分化、增殖和肿瘤恶性进展及化疗耐药等相关[17-19]。近年研究发现c-myc有望成为潜在的肿瘤治疗新靶点[20-21]。c-myc位于17p11.2～p12，早期研究发现13%～32%高级别骨肉瘤在此区域扩增，该区域还包括PMP22、TOP3A和MAPK7基因[22]。De Noon等[5]对1例4岁儿童高度侵袭性骨肉瘤标本进行全基因组测序，发现c-myc高水平扩增，他们也在其它队列研究中发现约15%患者存在c-myc高扩增。值得注意的是，生存分析也表明高c-myc扩增与临床转移密切相关[6]。目前，尚未有c-myc与骨肉瘤化疗耐药的相关报道。本组发现c-myc在骨肉瘤顺铂耐药细胞中的表达明显升高，FoxM1过表达细胞中c-myc表达增高，FoxM1抑制剂可以降低c-myc表达；联合FoxM1抑制剂增加骨肉瘤细胞耐药细胞对顺铂的敏感性；FoxM1和c-myc高表达组患者的总生存期显著低于低表达组，表明c-myc高表达和骨肉瘤化疗耐药相关，并且c-myc表达可能受FoxM1调控。研究发现FoxM1高表达组肺癌患者化疗后无进展生存期较短[23]，与本组结果一致。Grunblatt等[24]发现c-myc过表达介导肺癌对顺铂的耐药，抑制c-myc使耐药肿瘤细胞重新获得对化疗药物的敏感性。此外，也有研究报道c-myc原癌基因可能通过诱导肿瘤细胞的代谢参与化疗耐药[25]。目前，关于FoxM1和c-myc直接调控关系的研究报道较少，Pan等[26]应用定量CHIP技术在前列腺癌细胞中发现c-myc与FoxM1的启动子结合位点特异性结合。另有研究发现，c-myc抑制剂MYCi975也能够抑制FoxM1表达[27]。然而，在骨肉瘤中FoxM1和c-myc是否有直接调控关系，还需要行CHIP等实验进一步验证。

综上所述，FoxM1和c-myc高表达与骨肉瘤化疗耐药相关，且FoxM1上调c-myc表达促进化疗耐药，联合FoxM1抑制剂增加耐药细胞对顺铂的敏感性。本实验有助于理解骨肉瘤化疗耐药的分子机制，为临床逆转骨肉瘤化疗耐药治疗开发新的靶点和制定新的策略提供理论基础。