基于TCGA数据库的食管鳞状细胞癌差异表达焦亡相关基因的筛选及GSDMC基因的验证

苗婷婷，胡浇浇，郑士耀，孙 畅，杨 铭，曹玉文,，王良海,，胡建明,，沈西华，杨 兰,

食管癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，主要有两种组织学类型：食管腺癌和食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)[1-2]。我国食管癌主要以ESCC为主，患者预后差[3-5]。目前，靶向治疗为ESCC的治疗带来了希望，但其预后效果仍然不佳。因此，寻找ESCC患者新的预后生物学标志物可能会为靶向治疗提供新思路。细胞焦亡也称为炎症性死亡，是一种由半胱天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)介导激活，并通过切割gasdermin(GSDM)家族蛋白，使质膜穿孔，同时伴随炎性分子释放和免疫系统激活的细胞死亡方式[6-7]。有文献报道，细胞焦亡相关基因(pyroptosis-related genes, PRG)在多种肿瘤的进展和预后中起重要作用[8-9]。然而，关于PRG在ESCC组织中的表达及预后的研究较少。本文通过生物信息学法分析ESCC组织和正常食管黏膜组织中差异表达的PRG，探讨其与ESCC患者预后的关系，并运用体外实验对与ESCC患者预后相关的差异表达PRG基因进行验证和功能研究，为ESCC患者诊断、鉴别诊断及预后提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据来源从TCGA数据库(https: // portal. gdc. cancer. gov/)和GTEx数据库(http: // www. gtexportal. Org / home/)中获取82例人ESCC组织和82例人正常食管黏膜组织的转录组数据及患者的临床资料，包括ESCC患者ID号、性别、年龄、生存状态、生存时间、临床分期和肿瘤分级等。

1.2 细胞系及试剂人ESCC细胞系(KYSE-30、Eca-109、EC9706、KYSE-150、TE-1、KYSE-410)、人食管上皮细胞系HET-1A，均购自中国科学院上海细胞库。KYSE-30专用培养基购自武汉普诺赛公司，RPMI-1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司。GSDMC siRNA和阴性对照siRNA(negative control siRNA, NC siRNA)质粒，由上海吉玛基因公司设计和合成。转染试剂Lipofectamine 2000购自美国Thermo Fisher公司；RNA提取试剂盒购自美国Omega公司；逆转录试剂盒为美国Thermo Fisher公司；实时定量PCR试剂盒购自德国凯杰生物公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所。

1.3 差异表达PRG的筛选从Pubmed、中国知网和万方等数据库中下载并阅读细胞焦亡相关文献[10-14]，合计有33个PRG。用R软件“Limma”和“DESeq2”提取ESCC和正常食管黏膜组织中PRG的转录组数据，筛选差异表达的PRG，同时以log2FC>0.5和P<0.001为筛选标准，进一步绘制热图和条形图。

1.4 差异表达PRG和ESCC患者预后分析运用R软件“Limma”从TCGA数据库中提取ESCC患者的生存时间和生存状态(95例患者有64例生存，31例死亡)。用R软件“Survival”对差异表达的PRG与ESCC患者的生存时间进行Cox单因素、多因素回归分析，获得ESCC患者不良预后的独立危险因素，并绘制森林图。

1.5 细胞培养及转染KYSE-30细胞使用专用细胞基，其余细胞系均使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，在37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中进行培养。收集对数生长期的KYSE-30细胞，按照每孔4×105个细胞的数量接种于6孔板。待细胞融合度约为60%时，采用Lipofectamine 2000转染试剂分别将GSDMC siRNA和 NC siRNA转染到细胞中，7 h后更换培养基，48 h后收集细胞用于后续实验。GSDMC-Homo-960、GSDMC-Homo-1740和GSDMC-Homo-1244合计3对siRNA及1对无任何靶基因的NC siRNA，引物均由上海吉玛基因公司合成(表1)。

表1 GSDMC siRNA候选序列

1.6 qRT-PCR检测按照RNA提取试剂盒说明书提取RNA，并测定RNA浓度，通过逆转录得到相应的cDNA，随后进行qRT-PCR检测，每个样本同时扩增3个复管，并连续进行3次重复实验，采用2-△△Ct法计算目的基因表达量，引物由上海吉玛公司合成(表2)。

表2 qRT-PCR引物序列

1.7 CCK-8法检测细胞活力常规培养si-GSDMC组和si-NC组KYSE-30细胞，选取生长状态良好的两组细胞以每孔3×103个细胞接种于96孔板，37 ℃、5% CO2培养箱常规孵育过夜，收集1～5天的细胞，在避光条件下每孔加入10 μL CCK-8溶液，将培养板置于培养箱内孵育2 h，酶标仪检测450 nm处的吸光度(OD)值。

1.8 平板克隆实验检测细胞增殖将细胞以每孔 2×103个分别接种于6孔板，用KYSE-30细胞专用培养基在37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养，10天后PBS清洗3次。经4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3次；用0.1%结晶紫染色20 min，PBS清洗；采集图像并计数平板克隆形成数。

1.9 肿瘤免疫评估资源(TIMER)数据库分析使用TIMER数据库分析差异表达PRG的表达水平，与食管癌免疫微环境中免疫细胞浸润水平的相关性。

2 结果

2.1 ESCC组织中PRG的表达从TCGA和GTEx数据库下载82例ESCC组织和82例正常食管黏膜组织的转录组数据，筛选并分析33个PRG的mRNA表达，从中选出23个差异表达的PRG。其中，GSDMC、CASP5、NLRP6、IL-1β、TNF和PYCARD等13个基因在ESCC组织中表达上调，PRKACA、PLCG1、NOD1和GSDMD等10个基因在ESCC组织中表达下调(P<0.001，图1)。

图1 差异表达的PRG：A.差异表达的PRG热图，红色代表高表达，绿色代表低表达；B.差异表达的PRG条形图；***P<0.001

2.2 差异表达PRG与ESCC患者预后分析Cox单因素回归模型分析：差异表达PRG中的CASP5(HR=4.065 3，95%CI: 1.477 3～11.187 5，P=0.006 6)和GSDMC(HR=1.096 0，95%CI: 1.036 6～1.158 8，P=0.001 3)基因的表达水平与ESCC预后相关(图2A)。Cox多因素回归模型分析：GSDMC(HR=1.080 1，95%CI: 1.022 3～1.141 2，P=0.006 0)基因是ESCC患者不良预后的独立危险因素(图2B)。

图2 差异表达PRG与食管鳞状细胞癌患者预后分析：A.Cox单因素回归模型分析；B.Cox多因素回归模型分析

2.3 ESCC细胞株中GSDMC mRNA的表达qRT-PCR检测显示，与正常食管上皮细胞HET-1A(1.15±0.62)相比，GSDMC mRNA表达水平在食管癌细胞株EC9706(4.13±1.00)、Eca-109(5.01±2.17)、KYSE410(12.98±1.49)、TE-1(3.81±0.96)、KYSE-150(9.78±3.51)和KYSE-30(25.01±4.09)细胞中上调(P均<0.001，图3)，其上调趋势与TCGA数据库中的RNAseq数据一致。由于GSDMC基因在KYSE-30细胞系表达相对较高，故选择其进行下一步实验。

图3 qRT-PCR实验检测GSDMC mRNA在正常食管上皮细胞和食管鳞状细胞癌细胞中的表达：*P<0.05，***P<0.001

2.4 敲低GSDMC mRNA对ESCC细胞活力、克隆形成能力和凋亡的影响

2.4.1si-GSDMC筛选 qRT-PCR检测显示，转染GSDMC-Homo-960、GSDMC-Homo-1740及GSDMC-Homo-1244 siRNA的KYSE-30细胞中GSDMC mRNA表达量有不同程度的降低，与si-NC(1.00±0.08)相比，其中转染GSDMC-Homo-1244(0.27±0.11)的抑制效果最明显(t=9.355，P<0.001，图4)，将其用于后续实验。

图4 qRT-PCR实验检测敲低GSDMC mRNA的KYSE-30细胞中GSDMC mRNA表达水平：***P<0.001

2.4.2转染si-GSDMC检测ESCC细胞活力、平板克隆能力和凋亡 本组CCK-8、平板克隆实验及qRT-PCR检测显示，与si-NC组相比，si-GSDMC组ESCC细胞活力在转染后第1～5天均降低，其中第4天降低最明显[OD值：(1.73±0.07)vs(1.10±0.09),t=13.55,P<0.001] ，si-GSDMC组ESCC细胞克隆形成能力降低[克隆形成数目：(686±94.30)vs(377±77.31),t=4.389，P<0.05，图5、6)，凋亡能力增强[Bax：(1.00±0.08)vs(6.43±0.75)，t=12.51;BCL-2：(1.05±0.06)vs(0.26±0.12)，t=10.06，P均<0.001，图7]。

图5 CCK-8实验检测敲低GSDMC对KYSE-30细胞增殖能力的影响：**P<0.01，***P<0.001

图6 平板克隆实验检测敲低GSDMC对KYSE-30细胞克隆形成能力的影响：A.转染si-NC后，KYSE-30细胞的克隆形成能力；B.转染si-GSDMC后，KYSE-30细胞的克隆形成能力；C.敲低GSDMC后，KYSE-30细胞克隆形成能力的统计图,*P<0.05

图7 qRT-PCR实验检测敲低GSDMC对KYSE-30细胞中Bax和BCL-2表达的影响：***P<0.001

2.5 TIMER数据库分析运用TIMER数据库初步分析GSDMC mRNA表达与食管癌免疫细胞浸润水平之间的相关性。结果表明：GSDMC的mRNA表达与B细胞(r=-0.317，P=1.58e-05)、巨噬细胞(r=-0.252，P=6.48e-04)、CD8+T细胞(r=-0.15，P=4.44e-02)的浸润程度呈负相关，与树突状细胞(r=0.353，P=1.16e-06)、中性粒细胞(r=0.287，P=9.40e-05)的浸润程度呈正相关(图8)。

3 讨论

细胞焦亡是近期发现的一种程序性细胞死亡方式[15]。有文献报道，PRG与多种恶性肿瘤具有相关性[12]。如Feng等[16]研究发现，黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2, AIM2)炎性小体在胃癌组织和细胞中高表达，且促进胃癌细胞的增殖和迁移。此外，有文献报道GSDMD蛋白在非小细胞肺癌中表达上调，是肺腺癌的独立预后标志物，与肿瘤大小、TNM分期等有关[17]。本实验通过查阅文献获得33个PRG，并以此为基础展开分析。首先，对TCGA和GTEx数据库下载的ESCC和正常食管黏膜组织中33个PRG的mRNA表达水平进行分析，获得23个差异表达基因；提示这些差异表达PRG在ESCC中起重要作用。其次，进一步对差异表达PRG进行Cox单因素回归分析，结果发现GSDMC和CASP5基因与ESCC患者预后相关。最后，Cox多因素回归分析表明，GSDMC是ESCC患者的独立预后生物学标志物。

GSDMC是GSDM家族中的一员，广泛表达于食管、胃、肠、气管和皮肤中，其N端结构域能够诱导细胞发生焦亡[18]。有研究报道GSDMC在多种肿瘤的发生和预后中发挥重要作用，如GSDMC过表达能诱导乳腺癌细胞焦亡，且与乳腺癌患者生存期低有关[19]。在结直肠癌细胞中，GSDMC可能通过抑制TGF-β Ⅱ型受体的活性促进细胞增殖和肿瘤形成[20]。Yan等[21]研究表明在胰腺癌组织中GSDMC表达上调，与患者预后不良相关。此外，在胃癌细胞中GSDMC可能是一种潜在的肿瘤抑制因子，能够抑制胃癌细胞生长[22]。本组通过体外实验发现GSDMC在ESCC细胞中高表达，敲低GSDMC后能够抑制ESCC细胞的增殖和克隆形成能力，促进凋亡。

最近研究表明肿瘤细胞发生焦亡时，释放多种趋化因子和炎症因子，产生强烈的炎症反应，参与肿瘤免疫微环境的调节[23]。Xu等[24]通过生物信息学分析和实验验证，发现在乳腺癌中GSDMC高表达与乳腺癌患者的不良预后和免疫浸润细胞相关。此外，有研究者在肝细胞癌中发现GSDME能够促进CD8+T 细胞和B细胞的浸润，为肿瘤提供炎性微环境，从而参与肝细胞癌的抗肿瘤免疫[25]。本组运用TIMER数据库进一步分析GSDMC基因表达与食管癌免疫微环境的关系，结果显示GSDMC基因表达水平与食管癌B细胞、CD8+T细胞和巨噬细胞浸润程度呈负相关，提示GSDMC高表达的食管癌患者体液免疫和细胞免疫过程减弱。故推测高表达GSDMC的ESCC患者预后不良，可能是由于抗肿瘤免疫水平减弱导致的。

本文通过TCGA和GTEx数据库运用生物信息学筛选出与ESCC患者预后相关的差异表达PRG，并通过体外实验进一步验证了相关基因在ESCC细胞中的表达和生物学功能。结果显示：GSDMC基因在ESCC组织和细胞中高表达，与ESCC患者预后不良相关，且高表达GSDMC的ESCC患者免疫细胞浸润水平降低。GSDMC基因有望成为ESCC新的预后生物学标志物，并参与免疫细胞的浸润，为ESCC患者的靶向治疗及预后提供参考。