结肠癌组织中SRSF1蛋白的表达及其临床意义

王姝昊，常肖璐，赵 磊，孙紫洋，朴俊杰，林贞花，金爱花

结肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤，也是全球癌症死亡的主要原因[1]，其发病率在全球位居第3位，病死率位居第2位[2]，且其发病年龄呈年轻化趋势[3]。预计2030年全球结直肠癌新发病例数将超过220万，死亡例数将达110万[4]。随着医学水平的发展，肿瘤标志物在肿瘤的普查、诊断、预后评估和评价疗效等起重要作用。CA19-9、AFP、CEA等是应用较为广泛的肿瘤血清标志物，由于结肠癌组织的异质性和复杂性，目前尚未发现特异性较高的结肠癌标志物。因此，筛选可应用于临床的高特异性结肠癌标志物是当前亟需解决的问题。

富含丝氨酸/精氨酸剪接因子1(serine/arginine-rich splicing factor 1, SRSF1)又称为SF2/ASF，属于典型的SR蛋白家族成员[5]，其主要功能是参与细胞内mRNA的剪接作用。研究显示SRSF1可通过调控肿瘤相关基因的剪接过程，介导肿瘤细胞增殖与凋亡，进而参与肿瘤的发生、发展[6]。已有研究证实SRSF1高表达普遍存在于乳腺癌[7]、肺癌[8]、胃癌[9]等多种恶性肿瘤中，被认为是一种重要的原癌蛋白[10]。目前，关于SRSF1蛋白在结肠癌中的表达及其与患者预后关系的报道较少。因此，本文拟通过分析SRSF1蛋白在结肠癌组织中的表达及其与临床病理特征、预后的关系，旨在为结肠癌的诊断提供潜在的分子标志物。

1 材料与方法

1.1 临床资料结肠癌组织芯片(HColA180Su19)购自上海芯超公司，其中结肠癌组织94例，结肠癌癌旁正常组织86例，合计180点位。94例患者中男性48例，女性46例；年龄27～90岁，中位年龄65岁。随访截至2015年7月，患者生存期最长为78个月，最短为11天，中位生存期为70(23,75)个月。临床病理分期采用AJCC第七版癌症分期标准。

1.2 数据库分析应用TCGA数据库检索SRSF1 mRNA在33种肿瘤组织中的表达，通过TCGA官方数据库网站下载结肠癌STAR-Counts基因表达数据，整理获得mRNA差异表达矩阵，分析结肠癌与癌旁正常组织中SRSF1 mRNA表达水平的差异。应用GEO数据库分析结肠癌与癌旁正常组织中SRSF1 mRNA表达水平的差异。

1.3 免疫组化采用免疫组化SP法染色，切片常规脱蜡、抗原修复，加入一抗SRSF1(1 ∶50稀释)4 ℃孵育过夜；次日滴加二抗，DAB显色，Mayer苏木精对比染色，中性树胶封固。免疫组化检测SRSF1蛋白抗体的特异性，用已知阳性组织作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判断SRSF1定位于细胞质或细胞核中呈棕褐色为阳性，根据阳性细胞染色强度和阳性细胞百分率进行判断。(1)根据阳性细胞染色强度计分：未着色为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；黄褐色为3分。(2)根据阳性细胞百分比计分：阳性细胞数0～5%为0分；6%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。将上述两项得分结果相乘：0～3分为(-)，4～6分为(+)，7～9分为()，10～12分为()。其中，将()和()定义为SRSF1高表达。

1.5 统计学分析采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验方法，运用Kaplan-Meier法和Cox回归模型进行生存分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌中SRSF1 mRNA的表达通过TCGA数据库检索SRSF1基因在不同肿瘤中的表达，结果显示：SRSF1 mRNA在多种肿瘤组织(膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌、食管癌、结肠癌等)中表达增高；而在肾嫌色细胞癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤中表达降低(图1A)。TCGA数据库还显示SRSF1 mRNA在473例结肠癌组织中的表达水平显著高于41例正常结肠组织(P<0.01，图1B)；GEO检索显示GSE74604数据集中SRSF1 mRNA在结肠癌组织中的表达水平为(7 369.9±1 328.7)TPM，显著高于癌旁正常组织的(4 006.5±801.8)TPM(P<0.01,图1C)；GES10972数据集同样显示SRSF1 mRNA在结肠癌组织中的表达水平为(0.29±0.36)TPM，显著高于癌旁正常组织的(-0.40±0.33)TPM(P<0.01，图1D)。

图1 SRSF1 mRNA在结肠癌及癌旁正常组织中的表达及其与预后的相关性：A.SRSF1 mRNA在多种肿瘤中的表达(TCGA)；B.SRSF1 mRNA在结肠癌及癌旁正常组织中的表达(TCGA)；C.SRSF1 mRNA在结肠癌及癌旁正常组织中的表达(GSE74604数据集)；D.SRSF1 mRNA在结肠癌及癌旁正常组织中的表达(GES10972数据集)；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

2.2 结肠癌中SRSF1蛋白的表达本组对94例结肠癌组织及86例癌旁正常组织进行免疫组化染色，结果显示：SRSF1主要表达于结肠癌细胞胞核与胞质内(图2)。SRSF1蛋白在结肠癌组织中的阳性率和高表达率分别为92.6%(87/94)和67.0%(63/94)；在癌旁正常组织中的阳性率和高表达率分别为57.0%(49/86)、11.6%(10/86)。结肠癌组织中SRSF1蛋白表达与癌旁正常组织中相比，其在结肠癌组织中的表达显著增高，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

ABCD

表1 结肠癌、癌旁正常组织中SRSF1蛋白的表达

2.3 结肠癌中SRSF1蛋白表达与临床病理特征的关系SRSF1蛋白高表达与患者临床分期(χ2=4.835，P=0.028)密切相关，与患者性别(χ2=0.133，P=0.716)、年龄(χ2=1.178，P=0.278)、肿瘤大小(χ2=0.417，P=0.519)、分化程度(χ2=2.153，P=0.142)、原发肿瘤(T)分期(χ2=1.234，P=0.267)及淋巴结转移(χ2=3.700，P=0.054)无关(表2)。在临床分期Ⅲ～Ⅳ期患者中SRSF1蛋白的高表达率为80.6%(29/36)，显著高于Ⅰ～Ⅱ期患者(58.6%，34/58，P<0.05，表2)。

表2 结肠癌中SRSF1蛋白表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.4 结肠癌中SRSF1蛋白表达与患者预后的关系Kaplan-Meier生存分析结果显示：SRSF1蛋白高表达结肠癌患者的总生存期显著低于SRSF1蛋白低表达者(P=0.040，图3A)。为进一步分析SRSF1蛋白表达对结肠癌患者预后的影响，分别将结肠癌患者按分化程度、临床分期、淋巴结转移情况、原发肿瘤(T)分期及肿瘤大小分成亚组进行生存分析。结果显示：在pT为3～4及肿瘤最大径>5 cm的亚组中，SRSF1蛋白高表达患者预后较差，差异有统计学意义(P<0.05，图3B、C)。Cox单因素回归分析显示：淋巴结转移(HR：3.638，95%CI=1.913～6.917，P<0.001)、高临床肿瘤分期(HR：4.313，95%CI=2.228～8.348，P<0.001)及SRSF1蛋白高表达(HR：2.130，95%CI=1.010～4.492，P=0.047)是影响结肠癌患者预后的独立风险因素(图4)。

图3 结肠癌中SRSF1蛋白表达与患者生存期的关系：A.SRSF1表达水平与结肠癌患者总生存期的关系；B.SRSF1表达水平与pT为3～4的结肠癌患者生存期的关系；C.SRSF1表达水平与肿瘤最大径>5 cm的结肠癌患者生存期的关系

图4 Cox单因素回归分析结肠癌患者预后的独立风险因素：SRSF1蛋白高表达、淋巴结转移、临床肿瘤分期高是影响结肠癌患者预后的独立风险因素

3 讨论

随着医疗技术的不断提高，人类的平均寿命得以延长，然而恶性肿瘤的发生率却不断攀升，其中结肠癌已经成为影响人类生命健康的重要危险因素[11]。根据国际癌症研究机构GLOBOCAN 2020数据显示，全球约94万人死于结肠癌[12]。由于结肠癌发病具有极强的隐匿性，早期诊断率较低，大多数患者在确诊时已为中晚期[13]。

肿瘤的发生、发展受许多因子共同调控，这些调节因子可以调节癌基因或抑癌基因的表达，发挥促进或抑制肿瘤进展的作用[14]。剪接因子SRSF1是一种多功能蛋白质，参与调节选择性剪接与RNA代谢相关的过程。通常在癌症中可以观察到SRSF1表达的改变，包括选择性剪接、mRNA稳定性以及癌基因和肿瘤抑制因子的翻译紊乱。由于SRSF1在肿瘤进展中的重要作用，其有望成为抗癌治疗的靶点[15]。SRSF1位于染色体17q23上，该位点在某些肿瘤中通常被扩增且与不良预后相关[16-17]。Gout等[18]发现，与正常肺组织相比，非小细胞肺癌中这些剪接调节因子的整体过度表达与腺癌更具侵袭性的临床病理特征相关。Gout等提供的证据表明，人肺腺癌细胞模型中SRSF1过表达导致p42/44MAPK和AKT信号通路的激活，软琼脂中菌落形成增加，上皮向间充质转化，以及对卡铂和紫杉醇的耐药性，从而导致更具攻击性的表型。

目前，已有研究显示SRSF1的异常表达发生在不同的肿瘤中。祝兴旺等[19]发现SRSF1在膀胱尿路上皮细胞癌中高表达，并且与肿瘤的初发和复发、转移显著相关。Du等[20]采用免疫组化染色法和qRT-PCR分析证实：与正常组织相比，肿瘤组织中SRSF1在蛋白和mRNA水平显著均上调。Sheng等[21]通过KEGG分析发现，SRSF1的相关基因主要富集于细胞周期、肿瘤相关信号通路以及结肠癌相关信号通路，但尚未对结肠癌组织中SRSF1蛋白的表达及其临床意义进行深入分析。本组对94例结肠癌和86例癌旁正常组织进行免疫组化染色，发现SRSF1在结肠癌组织中显著高表达，且其高表达与结肠癌患者临床分期密切相关。以上结果说明SRSF1在结肠癌的发生、发展中起重要作用。

有研究显示，SRSF1蛋白是多种肿瘤的预后标志物。Liu等[22]通过Kaplan-Meier生存分析发现，SRSF1细胞核表达较高的患者总生存率较低。盛俊秀等[23]收集60例肺癌患者的临床数据，分析SRSF1在肺癌组织中的表达与生存率的相关性，结果表明SRSF1高表达患者的生存率明显低于SRSF1低表达患者。本组结果显示：随着SRSF1表达水平越高，结肠癌患者的生存期越短、预后越差，提示SRSF1在结肠癌组织中的表达可作为潜在的肿瘤标志物，其对临床诊疗中的预后判断具有重要指导意义。此外，SRSF1作为结肠癌患者的预后独立风险因素，或许可以通过降低SRSF1表达水平干预结肠癌的进展，促进患者预后。由于SRSF1在结肠癌中的分子作用机制尚未完全明确，还需积累更多病例进一步分析。