基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法同时快速测定保健食品中的降压物质

曾 羲，赵甜甜，刘春生，戚 平，钱振杰，曹霞飞，王 宇*，周庆琼，汪 宁

（1 广州市食品检验所 广州 511400 2 华南农业大学食品学院 广东省食品质量安全重点实验室 广州 510642 3 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所 广州 510610）

近些年，我国保健食品市场份额逐年攀升，保健食品行业涉及非法添加的化学药物主要有辅助降血压类、抗疲劳类、减肥类、提高免疫力类和辅助降血脂类[1]。我国的高血压患者已超2 亿，作为社会常见疾病之一，辅助降血压类保健食品也倍受消费者青睐，其中可能添加的化学药物主要涉及血管紧张素转化酶抵制剂（如卡托普利、阿替洛尔）、中枢神经和交感神经抑制剂（如盐酸可乐定、利血平）和β-受体阻滞剂（如美托洛尔）等[2]。已报道且常添加的降压物质包括盐酸可乐定、阿替洛尔、利血平、卡托普利、硝苯地平、氢氯噻嗪、哌唑嗪等[3-4]。长期服用高剂量添加降压物质的保健食品虽然可以实现快速降低血压的功效，但是会造成血压剧烈波动，对产品强烈依赖，损害肝肾和停药严重反弹等危害[5]。

保健食品中非法添加降压物质的检测方法主要有高效液相色谱（HPLC）法[6]、液相色谱-串联质谱（HPLC-MS）法[7]、液相色谱-四级杆-静电轨道阱高分辨质谱（HPLC Q-Orbitrap HRMS）法[8]、表面增强拉曼光谱（SERS）法[9]等。其中，HPLC 法分离效率高、重复性好[10]，HPLC-MS 法灵敏度高和强特异性[11]，现阶段这两种方法应用广泛；HPLC Q-Orbitrap HRMS 法可实现比HPLC-MS 法更高灵敏度的定性、定量检测；SERS 法操作简便，对实验人员的要求不高。上述方法前处理复杂，检测过程耗时长，基质效应显著[12]，且需消耗大量的试验耗材和有机试剂，不适合多批次、大批量保健食品中非法添加降压物质的筛查。

基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术具有灵敏度高，可高效精确判断分子质量，无需对样品进行分离就可直接点靶上机，样品和溶剂量消耗少，测定时间短等优势[13-14]，广泛应用于生物学、医学和化学领域，包括小分子药物[15]、寡糖[16]、脂质[17]、多肽和蛋白质[18-19]和聚合物[20]等。MALDI-TOF MS 的软电离方式能很好地保存小分子的完整性、分辨率高，在小分子分析筛查、鉴定方面存在巨大的潜力与优势[21]。虽然传统基质在质谱的低分子质量（<500 u）区域会产生较多基质碎片，但是在部分低分子质量区域并没有干扰，仍可实现对部分小分子化合物的检测。张培等[22]利用传统基质HCCA 和SA 实现了对孔雀石绿的定性、定量快速分析，样品分析时间仅需5 s 即可获得定量结果，说明传统基质在小分子化合物的检测领域还有很大的开发空间。本研究基于MALDI-TOF MS 法的优势以HCCA 为基质，研究盐酸可乐定、阿替洛尔和利血平等3 种降压效果明显、原料价格低廉的非法添加物的快速筛查方法，旨在填补MALDI-TOF MS 法传统基质在保健食品中小分子非法添加物定性、定量分析上的空白，减少单个样品的筛查时间，用于大批量样品的筛查和阳性样品的精准定量，为保健食品行业的健康有序发展提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

21 批保健食品均购于网络；甲醇（色谱纯级），美国Thermo Fisher Scientific 公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid），德国Bruker 公司；盐酸可乐定标准品（HCD，批号：100071-201607）、阿替洛尔标准品（ANL，批号：100117-201606）、利血平标准品（RSP，批号：100041-202015），中国食品药品检定研究院提供；本试验用水均由Milli-Q 超纯水制备系统制得，美国Millipore 公司。

1.2 仪器与设备

MS205DU 电子天平，上海梅特勒-托利多国际贸易有限公司；ultraflextreme MALDI-TOF MS仪（配有flexAnalysis 3.4 数据分析系统）、384 孔ground steel 靶板，德国Bruker 公司；2600TH 超声清洗仪，上海安谱科学仪器有限公司；M3 7610-33CN 涡旋混合仪，美国Thermo Fisher Scientific公司；Allegra X-30R 高速冷冻离心机，美国Beckman 公司。

1.3 标准溶液和基质配制

1.3.1 标准溶液的配制 分别准确称取各标准品10.00 mg，用甲醇振荡溶解并定容于10 mL 容量瓶中，得到质量浓度为1 mg/mL 的标准储备液，于-18 ℃避光贮存。分别精密量取上述储备液0.1 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，得到10 μg/mL 的混合标准溶液。临用时将上述混合标准溶液用甲醇-水（1 ∶1，体积比）液稀释至100 ng/mL，分别移取适量100 ng/mL 混合标准溶液配制成质量浓度为10，20，40，60，80 ng/mL 和100 ng/mL 的标准曲线。以同样方法配制100 ng/mL 盐酸可乐定（HCD）、阿替洛尔（ANL）、利血平（RSP）单个标准溶液。

1.3.2 基质的配制 称取4.0 mg HCCA 基质于离心管中，加入甲醇-水（1 ∶1，体积比），配成质量浓度为4.0 mg/mL 的HCCA 基质溶液，超声溶解10 min。

1.4 样品前处理

在前期研究[7]基础上稍作修改，即固体或半固体样品研细混均、液体样品摇匀后，准确称取0.2000 g 样品于10 mL 比色管中，加入甲醇-水（1 ∶1，体积比）溶液定容，超声提取10 min，固体和半固体样品经8 000 r/min 离心3 min 后取上清液备用，液体样品可直接上机测定。加标样品在称量后分别加入对应质量浓度（即0.75，2.0 μg/g 和4.0 μg/g）的混合标准溶液，再进行定容提取操作，每个样品重复测定3 次。

1.5 点样与MALDI-TOF MS 分析条件

1.5.1 点样方式 基质结晶质谱信号不稳定、响应重复性差和甜点效应是影响MALDI-TOF MS定量分析测定的关键问题，不同基质与不同样品生成的结晶不同，产生的问题也不尽相同[21]。本试验将100 ng/mL 的混合标准溶液作为样品、以HCCA 为基质，考察双铺法a、双铺法b、混合法和三明治法等4 种不同的点样方式，解决样品与HCCA 基质混合所得结晶不均造成质谱信号不稳定及响应重复性差的问题。

1.5.1.1 双铺法a 先移取1 μL 样品于384 孔ground 靶板上，自然挥干后，再移取1 μL 基质覆盖，自然挥干待测。

1.5.1.2 双铺法b 先移取1 μL 基质于384 孔ground 靶板上，自然挥干后，再移取1 μL 样品覆盖，自然挥干待测。

1.5.1.3 混合法 取2 μL 样品和2 μL 基质混合均匀后，取2 μL 混合物直接于384 孔ground 靶板上点样，自然挥干待测。

1.5.1.4 三明治法 取0.5 μL 基质溶液于384 孔ground 靶板上，自然挥干后，取1 μL 样品覆盖基质，自然挥干后，再取0.5 μL 基质溶液挥干待测。

1.5.2 MALDI-TOF MS 条件 点靶光源：氮气激光；离子源：电喷雾电离（ESI）源；波长：337 nm；检测模式：反射线性正离子模式；采集范围：160～3 580 u；激光强度为：60%；光谱响应强度叠加次数均为20 次，利用仪器配置的flex Control 软件对质谱图进行质量轴的质荷比（m/z）进行标记和默认平滑处理，并用flexAnalysis 3.4 软件分析原始数据，根据叠加所得目标物对应离子的峰面积换算成对应标准曲线中盐酸可乐定、阿替洛尔和利血平的含量。

2 结果与分析

2.1 质谱裂解规律的研究

3 种降压物质的单个标准溶液响应效果和质谱裂解规律，均与溶剂空白的HCCA 基质进行比较，结果如图1所示。

MALDI-TOF MS 对目标物离子化形式通常有[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+等3 种[23]，由图1 可以看出，3 种降压物质质谱峰的离子化形式均为[M+H]+，即分别为[HCD+H]+（m/z229.913）、[ANL+H]+（m/z267.099）和[RSP+H]+（m/z609.355），与Manka 等[23]报道的MALDI-TOF MS 带电裂解规律一致。虽然HCCA 空白基质在质荷比（m/z）160～450 u范围内存在较多碎片，但是其在3 种降压物质对应的质荷比（m/z）处干扰很小，即HCCA 空白基质在对应质荷比处的信噪比（S/N）小于3，故可忽略基质的影响，可利用HCCA 作为3 种降压物质的分析测定基质。

图1 3 种降压物质与对应空白基质的MADLDI-TOF质谱图Fig.1 MALDI-TOF mass spectrum of 3 kinds of anti-hypertensive substances to corresponding blank matrix

2.2 点样方式的考察

不同点样方式对应的样品与基质结晶在质谱仪高倍放大镜下的光学图像见图2，从样品与基质的结晶来看，混合法最均匀，其次为双铺法，最后为三明治法。通过对每个样品进行反射线性正离子模式采集20 次叠加得到的质谱图来看，混合点样法随机采集的20 次质谱信号均较稳定、重复性好且没有甜点效应；双铺法叠加得到响应强度与混合点样法相当，无甜点效应，但质谱信号稳定性和重复性劣于混合点样法，且先点样品再点基质和先点基质再点样品对MALDI-TOF MS 叠加响应强度基本无影响；三明治法产生的质谱信号虽强于其它2 种方法，但质谱信号的稳定性和重复性不佳，且会出现部分甜点效应。因此，综合考虑试验操作方便快捷、甜点效应、质谱信号重复性、稳定性和定量分析等因素，选用混合法作为本研究的点样方式。

图2 4 种点样方式形成的HCCA 与样品共结晶在质谱仪高倍放大镜下的光学图像Fig.2 Images of HCCA and sample crystal formed by 4 kinds of spotting approaches under the high magnification lens in the mass spectrometer

2.3 激光强度的选择

HCCA 基质与100 ng/mL 的3 种降压物质混合标准溶液形成的结晶在10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%等9 种激光能量强度的MALDI-TOF-MS 响应效果如图3所示。

从图3 可以看出，激光能量强度为10%～60%时，随着激光能量强度的增加，3 种化合物与HCCA 形成的共结晶质谱响应强度从105增加到106，说明激光能量强度对质谱峰信号影响较大；当激光强度超过60%时，HCD 和RSP 的质谱响应强度增加较慢，ANL 的质谱响应强度甚至略有降低。一般而言，质谱峰叠加强度在105即可认为响应良好，且过高的激光强度不利于离子源的维护。因此，选用60%的激光强度作为MALDITOF MS 对3 种降压物质的定性定量研究分析。

图3 9 种激光能量强度的HCCA 与样品共结晶响应强度比较（n=3）Fig.3 Comparison of response intensity on HCCA and sample crystal formed by 9 different laser energy intensities（n=3）

2.4 方法学评价

2.4.1 筛查限及线性范围 按1.3 节中方法配制混合标准曲线，以3 个降压物质叠加所得目标离子峰面积（y）对应的质量浓度（x，ng/mL）分别绘制标准曲线，线性范围和相关系数见表1。本研究的筛查限[24]（Limit of identification, LOI）为仪器测定标准溶液的最低质量浓度（S/N≥3）对阴性样品提取液加标试验后，验证所得实际加标样品最低质量浓度（S/N≥3），结果如表1所示。从表1可以看出，3 种小分子降压物质在线性范围内相关系数（r）≥0.99，说明线性良好，能满足筛查测定要求；3 种样品中的LOI 范围为0.005～0.25 μg/g，LOI 值从低到高依次为RSP、HCD、ANL；同种降压物质比较，液体样品的LOI 值最低，其次为半固体样品，最高为固体样品。

表1 3 种降压物质在3 种阴性样品中线性范围、相关系数和筛查低限Table 1 Linear range, correlation coefficients（r）and limit of identification（LOI）of 3 anti-hypertensive substances on 3 negative samples

2.4.2 加标回收试验及精密度 3 种阴性样品外标法定量的回收率结果见表2。结果表明，采用传统基质HCCA 作为MALDI-TOF MS 测定3 种降压物质的加标回收率67.56%～104.70%，相对标准偏差（RSDs）为0.43%～10.51%，说明本试验方法可满足定量分析测定要求。

表2 3 种降压物质在低、中、高3 个水平下的加标回收率和相对标准偏差（n=3）Table 2 Spiked recoveries and relative standard deviations of 3 anti-hypertensive substances on low,medium and high levers（n=3）

2.5 实际样品检测

应用本研究方法检测21 种市售保健食品，包括口服液、保健酒等液体，片剂、硬胶囊等固体，软胶囊等半固体，通过对比实际样品在对应目标物质荷比的峰响应强度，进行定性分析筛查，结果发现，有1 种样品添加了盐酸可乐定，含量为（10.79±0.95）μg/g。

3 结论

本研究建立了传统基质HCCA 作为基质，应用MALDI-TOF MS 软电离分析技术快速定性、定量检测保健食品中添加的3 种降压物质的方法，填补了传统基质对小分子化合物分析测定保健食品非法添加药物的空白。该方法不仅灵敏度高、筛查结果准确、精密度好，且抵抗样品干扰的能力强、无需复杂前处理、流动相和色谱柱，每个样品经仪器分析仅需0.3 s 即获得筛查结果，且靶板可重复使用，可满足应急抽检、日常检验等大批量、多批次保健食品中降压物质的筛查检测，一次最多可检测384 个样品。

MALDI-TOF MS 在小分子分析测定方面存在巨大优势，可为保健食品非法添加物的风险评估提供快速、准确和极其高效的筛查方法，然而目前的基质难以实现对所有非法添加物的分析筛查，因此，开发广谱性、适用所有小分子分析筛查的基质是接下来的重点研究方向。