贻贝豆酱发酵工艺对其挥发性风味物质及抗氧化性的影响

郭丽平，闫 文，2，戴志远，2，3*

（1 浙江工商大学海洋食品研究院 杭州 310035 2 浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室 杭州 310035 3 海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心 辽宁大连 116000）

贻贝是一种分布广泛的海洋双壳贝类，又叫青口，被誉为“海上鸡蛋”，富含蛋白质、维生素、微量元素和牛磺酸等成分，营养和药用价值极高[1-2]。贻贝的养殖成本低，生命力强，我国海水养殖贻贝产量居世界前列[3]。然而，贝类的采捕期短，目前主要以鲜销和干制品为主，产品形式单一，限制了贻贝产业的可持续发展[4]。

近年来，随着人们对食品的需求由安全营养型到风味型、天然型和功能型的转变，充分利用水产品资源生产高品质复合天然系调味料越来越重要[5]。典型的水产调味料有蚝油、鱼露、蟹酱、虾酱等，除了种类齐全、配比合理的氨基酸，贝类牛磺酸和活性肽有助于人体健康[6]。目前，对水产调味料的开发，大部分集中在酶解和发酵两种手段，酶解工艺虽简单，但产品腥味难以消除，市场接受度较低[7]。发酵能够产生丰富酶系，且有一定的脱腥效果，但利用贻贝发酵的相关报道较少。

本文以冷冻贻贝肉、黄豆、大米为原料，采用米曲霉制曲后混合发酵，通过单因素实验确定贻贝豆酱的适宜发酵条件，并对发酵前、后挥发性风味物质及抗氧化性变化进行评价，旨在为开发贻贝发酵产品提供参考。对于提高贻贝资源利用水平，增加其附加值具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豆、大米、食盐，杭州市教工路物美超市；酱油曲精，久微食品科技（上海）有限公司；冷冻贻贝肉，浙江省嵊泗县华利水产有限公司。

甲醛水溶液、0.05 mol/L 氢氧化钠标准滴定溶液、2-甲基-3-庚酮（分析纯级）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼、2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪、邻-羟基苯甲酸、四水合氯化亚铁、乙氧烷，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

MLS-3781L-PC 高压蒸汽灭菌器，松下健康医疗器械株式会社；BSA124S-CW 电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；HS-1300U 型超净工作台，苏州净化设备有限公司；Bluepard 恒温恒湿箱、电热培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；ST3100/F 台式PH 计，奥豪斯仪器（常州）有限公司；SPECTRA MAX 190 酶标仪，美国分子仪器有限公司；紫外-可见分光光度计、Trace GC ultra 气相色谱-DSQ II 质谱联用仪，美国Theremo Fisher Scientific 公司；DP-5MS 石英毛细管色谱柱（30 m× 0.25 mm，0.25 μm）、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头，上海安谱实验科技股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 贻贝豆酱的制备方法 贻贝豆酱的制备方法如下：

操作要点如下：先分别制豆曲和米曲，曲精接种温度40 ℃，接种量为原料质量的0.01%，在恒温31 ℃、湿度≥85%的条件下培养，至表面呈嫩黄绿色收曲。后加入贻贝肉和食盐，拌匀后恒温混料发酵一定时间，经研磨和巴氏杀菌后成贻贝豆酱成品。

1.3.2 单因素实验设计 以氨基酸态氮含量及感官评分作为评价指标，分别考察食盐添加量、曲贝质量比、发酵温度和发酵时间4 个因素对贻贝豆酱品质的影响。

1.3.2.1 食盐含量对贻贝豆酱品质的影响 在曲贝质量比1 ∶1、发酵温度40 ℃、发酵时间21 d 的条件下，设定不同的食盐添加量（10%，12%，14%，16%，18%）。

1.3.2.2 曲贝质量比对贻贝豆酱品质的影响 在食盐添加量14%、发酵温度40 ℃、发酵时间21 d的条件下，设定不同的曲贝质量比（1∶4，1∶2，1∶1，

2∶1，4 ∶1 ）。

1.3.2.3 发酵温度对贻贝豆酱品质的影响 在曲贝质量比为1∶1、食盐添加量14%、发酵时间21 d的条件下，设置不同的发酵温度（30，35，40，45，50℃）。

1.3.2.4 发酵时间对贻贝豆酱品质的影响 在曲贝质量比为1∶1，食盐添加量14%，发酵温度40℃的条件下，设置不同的发酵时间（15，18，21，24，27 d）。

1.3.3 氨基酸态氮含量的测定 采用GB 5009.235-2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸态氮的测定》[8]中酸度计法。

1.3.4 感官评定 采用感官量化描述分析法（Quantitative description analysis，QDA），挑选8名经过训练的食品专业研究生组成的感官评定小组进行测评，对贻贝豆酱的感官特性进行评价。贻贝豆酱的感官指标主要从色泽、体态、气味、滋味4 个方面来评定，评分标准见表1。

表1 贻贝豆酱感官评价标准Table 1 Sensory evaluation criteria of mussel bean paste

1.3.5 挥发性风味物质的测定

1.3.5.1 顶空固相微萃取条件 研磨贻贝豆酱进样量4 g，培育温度70 ℃保持40 min，50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取纤维头，老化温度250 ℃，解吸时间10 min，自动进样。

1.3.5.2 气相色谱条件 进样口温度250 ℃；进样方式：不分流；载气：氦气（纯度99.99%）；流速1.0 mL/min；色谱柱：DP-5MS 石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温条件：40 ℃保持2 min；以4 ℃/min 升至92 ℃，保持2 min；5 ℃/min 升至200 ℃，保持0 min；6 ℃/min 升至240 ℃，保持6 min。

1.3.5.3 质谱条件 电子轰击离子源，电离电压70 eV，传输线温度250 ℃，离子源温度250 ℃，质量扫描范围33～450 u。

1.3.5.4 定性与定量分析 采用NIST 质谱数据库检索，选择正反匹配度大于750 的化合物进行定性分析；依据化合物峰面积比值与质量浓度呈正比的原理，计算每一种化合物相对于内标化合物的质量浓度。未知挥发性化合物含量按下式计算。

式中，Cx——未知挥发性化合物含量，g/kg；Co——内标化合物质量浓度，g/μL；Vo——内标化合物进样体积，μL；Sx——未知挥发性化合物的峰面积，AU·min；So——添加的内标化合物峰面积，AU·min；m——样品质量，kg。

1.3.6 体外抗氧化性的测定 参照赵晓娟[9]的方法，分别称取5.0 g 发酵前、后贻贝豆酱样品，加入100 mL 60%乙醇溶液均质后浸提30 min，并用60%乙醇溶液稀释成10，20，30，40 mg/mL 的质量浓度，分别测定总抗氧化能力、羟自由基（·OH）清除率。

1.3.7 数据处理 每个试验重复3 次，利用SPSS 19.0 统计软件对数据进行统计处理和显著性分析，利用Origin 软件作图。

2 结果与分析

2.1 贻贝豆酱发酵工艺单因素实验

2.1.1 食盐添加量对贻贝豆酱感官及氨基酸态氮含量的影响 氨基酸态氮是指以氨基酸形式存在的氮元素，是判定发酵产品发酵程度的特性指标，该指标越高，产品鲜味越好，品质越高[10]。由图1可知，随着食盐添加量由10%上升到18%，贻贝豆酱氨基酸态氮含量从0.86 g/100 g 逐渐降低至0.53 g/100 g。各组氨基酸态氮含量均符合不低于0.3g/100 g 的国家标准[11]。随着食盐添加量的增加，贻贝豆酱的感官评分呈先升高后降低的趋势。食盐在发酵过程中既可防腐抑菌保证产品质量，也可筛选对发酵有益的嗜盐或耐盐微生物，影响水解酶活性，从而影响发酵进程[12]。食盐添加量较低时，贻贝豆酱的氨基酸态氮含量虽然较高，但有酸味，这可能是因为添加的食盐较少，未能有效抑制腐败或产酸微生物[13]，而过高的食盐添加量使水分活度降低，抑制了微生物代谢以及水解酶活性，氨基酸态氮含量减少。在食盐添加量为14%时，贻贝豆酱无酸败气味，海鲜香气协调，且咸甜适中，口感醇厚，呈黄棕褐色且透亮有光泽，体态黏稠适中，均匀细腻，感官评分最高。因此，确定食盐添加量为14%。

图1 食盐添加量对贻贝豆酱感官及氨基酸态氮含量的影响Fig.1 Effects of salt content on sensory and amino acid nitrogen contents of mussel bean paste

2.1.2 曲贝质量比对贻贝豆酱感官及氨基酸态氮含量的影响 由图2 可知，随着曲贝质量比增大，贻贝豆酱的氨基酸态氮含量由0.68 g/100 g 逐渐下降至0.45 g/100 g，感官评分则呈现倒“V”型趋势。各组感官评分差异显著的原因在于贝肉与曲料在发酵过程中的作用不一，且二者成分差异较大。贝肉主要提供发酵原料蛋白质等，其水分含量高；而曲料主要作为发酵剂的载体，身上附着大量酶系与少量微生物[14]，其水分含量较低。曲贝质量比为1∶4，1∶2 时，发酵剂不足，发酵不完全，发酵后贻贝豆酱较稀不成型，色泽偏向黄绿色，腥味浓郁，感官不可接受。曲贝质量比为2∶1，4∶1 时，贻贝豆酱体态黏稠，呈黑棕色且无光泽，发酵海鲜香味淡。因此，确定曲贝质量比为1∶1，此时贻贝豆酱的氨基酸态氮含量适中，感官评分达89 分。

图2 曲贝质量比对贻贝豆酱感官及氨基酸态氮含量的影响Fig.2 Effect of trabecula proportion on sensory and amino acid nitrogen contents of mussel bean paste

2.1.3 发酵温度对贻贝豆酱感官及氨基酸态氮含量的影响 由图3 可知，随着温度上升，贻贝豆酱的氨基酸态氮含量呈先升高后降低又回升，各组氨基酸态氮含量均远超过酱类国家最低氨基酸态氮限量标准；感官评分则呈现明显的先上升后下降的趋势，在40 ℃时感官评分最高。温度不仅是保证微生物生长及酶系作用的重要前提[15]，还与氧化反应、Strecker 降解和美拉德反应、酯化反应及微生物代谢等生成风味物质的生化反应有关[16]。综上，40 ℃是贻贝豆酱最适宜的发酵温度条件。

图3 发酵温度对贻贝豆酱感官及氨基酸态氮含量的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory and amino acid nitrogen contents of mussel bean paste

2.1.4 发酵时间对贻贝豆酱感官及氨基酸态氮含量的影响 由图4 可知，随着发酵时间的延长，贻贝豆酱的感官评分与氨基酸态氮含量均呈先升高后降低的趋势。发酵过程中，微生物产生的酶系水解原料，积累风味前体物质的水解反应与生成风味物质的复杂生化反应持续进行[17]。发酵第15 天时，氨基酸态氮含量较低，总体感官不可接受，可能是处于风味前体物质已经积累，而大量的风味物质还未形成的阶段。发酵进行到第24 天时，氨基酸态氮含量达到最高为0.84 g/100 g，感官评分也达到最高。继续发酵至第27 天时，数值略有下降。推测原因是受到蛋白酶活力下降，微生物代谢及美拉德等反应的影响，氨基酸态氮及风味物质积累的速度低于分解的速度有关，这与王沛[18]、王雪梅[19]的研究结果一致。故确定发酵终点时间为24 d。

图4 发酵时间对贻贝豆酱感官及氨基酸态氮含量的影响Fig.4 Effect of fermentation time on sensory and amino acid nitrogen contents of mussel bean paste

2.2 发酵对贻贝豆酱挥发性风味成分及含量的影响

发酵前、后共检测到71 种挥发性风味物质，包括芳香化合物类、醇类、酯类、醛类、酚类、含氮化合物、含硫化合物和烃类共8 个种类。发酵前挥发性物质共34 种，总含量为4 633.48 μg/kg，发酵后挥发性物质共55 种，总含量为6 397.01 μg/kg，发酵前后挥发性成分差异显著（P＜0.05）。

醇类一般是与脂肪酸的氧化或羰基化合物还原相关，低碳醇挥发性好，对风味贡献较大[20]。检测到发酵前、后醇类物质种类均为5 种，经过发酵，贻贝豆酱醇类物质相对含量12.7%下降至5.8%。醇类是醛酮类的前体物质，对贻贝豆酱的风味具有加和作用[21]。

醛类挥发性物质涉及到化学变化主要是发酵过程中的脂肪酸氧化反应以及氨基酸代谢反应[20]。醛类的阈值低于醇类，且具有重叠风味的效应[22]。发酵前检测到贻贝豆酱醛类物质4 种，发酵后增加了4 种，含量是发酵前的3.6 倍。主要增加的风味物质异戊醛、2-甲基丁醛、10-十八碳烯醛、苯甲醛、苯乙醛、硬脂烷醛的特征香气分别是酱油味和苹果香、麦芽香、水果香、杏仁香、花香及水果香气[23]。醛类占总挥发性风味物质相对含量由发酵前的7.5%升高到发酵后18.5%，对贻贝豆酱风味有重要贡献。发酵后异戊醛、2-甲基丁醛、苯乙醛的含量都远远超过其气味阈值0.25，0.9 μg/kg 及9 μg/kg[24]，是贻贝豆酱特征性风味的主要成分。

酯类物质主要由微生物利用醇和酸进行酯化作用产生，挥发性强且气味阈值低，短链酯通常具有水果和花香等令人愉悦的气味，长链酯通常具有油脂味[25]。经米曲霉发酵处理后，贻贝豆酱中酯类物质的相对含量由26.5%增至45.9%，种类由13 种增至20 种。其中，肉豆蔻酸乙酯、癸酸癸酯、棕榈酸甲酯、棕榈酸乙酯、油酸乙酯等酯类物质使贻贝豆酱香气醇厚。此外，贻贝豆酱中还检测到亚油酸乙酯、亚麻酸乙酯以及二十碳五烯酸甲酯。

芳香化合物是食用香料的重要来源，主要由芳香族氨基酸降解产生，气味阈值一般较高[26]。发酵后芳香化合物的种类由3 种增至13 种，相对含量从13.6%下降至12.3%。贻贝豆酱中的芳香化合物大部分归属于苯类、萜烯类及杂环化合物（吲哚、唑）类芳香化合物[27]。烃类物质主要来源于脂肪或者氨基酸的氧化，是肉类风味物质的中间体，基本无香气[28]。

表2 贻贝豆酱发酵前、后挥发性风味物质的组成与含量占比Table 2 Composition and content of volatile compounds before and after fermentation of mussel bean paste

（续表2）

（续表2）

2.3 发酵对贻贝豆酱体外抗氧化性的影响

FRAP 法可以体现体系内的总抗氧化能力[29]，是常用的评估体系抗氧化能力的指标。由图5所示，随着质量浓度的增加，贻贝豆酱发酵前后的总抗氧化能力均不断上升，未发酵贻贝豆酱的总抗氧化能力由7.54 mmol FeSO4/g 上升至42.39 mmol FeSO4/g，发酵后贻贝豆酱总抗氧化能力由26.71 mmol FeSO4/g 升高至129.52 mmol FeSO4/g。同一质量浓度下，发酵后贻贝豆酱的总抗氧化能力是未发酵组的3 倍左右，二者呈明显的正相关，这说明发酵能够使贻贝豆酱体系中的抗氧化物质增多，总抗氧化能力增强。

图5 贻贝豆酱浸提液的总抗氧化能力Fig.5 Effect of mussel bean paste extracts on total antioxidant capacity

羟自由基被认为是目前已知的氧化能力最强和危害性最大的活性氧之一，与机体衰老、肿瘤发生发展有关[30]。由图6 可知，发酵前、后贻贝豆酱均有一定的清除羟自由基的能力，说明贻贝豆酱中含有能够阻止羟自由基产生的物质。随质量浓度的增大，发酵前、后两组贻贝豆酱羟自由基清除率分别由7.4%和16.2%增大至32.6%和74.0%。同一质量浓度下，发酵组羟自由基清除率均是未发酵组的3 倍左右。以上结果表明羟自由基清除率与质量浓度线性相关，且发酵可以大大增强贻贝豆酱的羟基自由基清除能力。此结论与武悦等[31]关于黑豆丹贝抗氧化性的研究结果一致。

图6 贻贝豆酱浸提液的羟自由基清除率Fig.6 Effect of mussel bean paste extracts on hydroxyl radical scavenging rate

3 结论

利用贻贝、黄豆等为主要原料，酱油曲精为发酵剂，混料发酵制备贻贝豆酱，并探究了发酵前、后贻贝豆酱的挥发性风味物质及体外抗氧化性的变化。通过单因素实验确定发酵条件为：食盐含量为14%，曲贝质量比1 ∶1，发酵温度40 ℃，发酵24 d。制得的贻贝豆酱氨基酸态氮含量高达0.84 g/100 g，感官品质较好。经过发酵，贻贝豆酱的香气种类及相对含量更为丰富。原料的贻贝原料腥味以及豆腥味减轻，海鲜风味、豆酱香味得到丰富。发酵使贻贝豆酱的羟自由基清除能力、FRAP总抗氧化能力显著增强。后续应进一步研究贻贝豆酱发酵过程中的生化动态及风味物质变化，以期为贻贝豆酱的深度开发提供理论依据。