浊点萃取—异辛烷反萃取—气相色谱质谱法测定茶饮料中8种农药残留

谢 洁 周 闰 孔令灿 孟元华 王 宇

(1.无锡市疾病预防控制中心，江苏 无锡 214023；2.南京医科大学，江苏 南京 211166)

随着生活节奏的不断加快，人们对茶产品的要求逐渐向方便化趋势发展，茶，正以时尚化、便捷化的方式进入人们的生活。随着茶饮料的大量普及，相应的安全问题也受到社会的大量关注，如农残检测[1]。在茶饮料中，农残含量相对较低，按照目前传统的检测方法，在检测中需要用到大量的有机溶剂，更需要花费大量时间在浓缩提取过程上，操作繁琐，费时费力。

国内外对于农药残留的分析报道中，仪器方法主要有：免疫分析技术[2]、气相色谱[3]、毛细管电泳技术[4]、气相色谱—质谱联用[5-6]、液相色谱—质谱联用[7]、超高效液相色谱—质谱联用[8-9]等。其中，样品前处理技术多为分散固相萃取[10-11]、分散液液微萃取[12]、固相萃取柱净化[6]、QuEChERS净化[13-14]等，在操作过程中均需使用大量有机溶剂，耗时长，操作步骤繁琐，且需要复杂的净化步骤。浊点萃取法(cloud point extraction，CPE)能在一定程度上避免上述问题，研究拟以表面活性剂水溶液作为萃取剂，通过表面活性剂的增溶性和浊点分相来对目标物进行分离和富集，表面活性剂中的目标物则通过微量的有机溶剂萃取出来，该方法不但能提高富集倍数，同步完成待测组分的提取和净化，也能有效避免表面活性剂的高黏度对检测仪器产生的影响。该技术目前已被广泛应用于重金属分析[15]、食品工业[16-17]、金属离子形态分析[18-19]、环境污染物检测[20-21]、环境有机分析[22]等领域，但是关于浊点萃取反萃取法同时富集分离茶饮料中多种农药的研究尚未见报道。

研究拟以非离子表面活性剂PEG 4000作为萃取剂从茶叶饮料中提取和预浓缩8种农残，再从获得的富含表面活性剂相中反萃取到异辛烷中。从而建立从茶饮料中同时提取检测多种农药残留的浊点萃取方法，以期为茶饮料中拟除虫菊酯和有机氯类农药残留的检测提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器

气相色谱/质谱仪：7890B-7000C型，美国Agilent公司；

超纯水系统：Milli-Q型，美国Millipore公司；

高速冷冻离心机：3-30K型，美国Sigma公司；

电子天平：XS105DU型，美国Mettler Toledo公司；

超声仪：SCQ-10018型，上海声彦超声波仪器公司；

涡旋混合器：G560型，美国Scientific Industries公司。

1.1.2 试剂与材料

艾氏剂(CAS：309-00-2)、狄氏剂(CAS：60-57-1)、六氯苯(CAS：118-74-1)、七氯(CAS：76-44-8)、氯氰菊酯(CAS：52315-07-8)、甲氰菊酯(CAS：64257-84-7)、溴氰菊酯(CAS：52918-63-5)、氰戊菊酯(CAS：51630-58-1)：纯度≥99.5%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；

正己烷：色谱纯，德国默克公司；

异辛烷：色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

石油醚：色谱纯，美国TEDIA公司；

茶饮料6种：市售；

PEG 4000：分析纯，韩国乐天公司；

Tween-20：分析纯，德国默克公司；

Triton X-100：分析纯，美国Sigma公司；

氯化钠、无水硫酸钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

试验用水：符合GB/T 6682—2008《分析实验室用水规格和试验方法》规定的一级水。

1.2 方法

1.2.1 农药标准溶液的配制 分别取适量8种农药标准品，用正己烷配制成质量浓度为5 mg/L的4种有机氯类农药和质量浓度为10 mg/L的4种拟除虫菊酯类农药的混合标准中间液，-20 ℃保存备用，有效期为6个月。再用异辛烷逐级稀释，有机氯类农药逐级稀释为2.0，1.0，0.5，0.1，0.05，0.01 mg/L的混合标准储备液，拟除虫菊酯类农药逐级稀释为4.0，2.0，1.0，0.2，0.10，0.02 mg/L的混合标准储备液，均保存于4 ℃，有效期为2～3周。

1.2.2 样品前处理

(1)浊点萃取方法：采集市场上不同品牌的6个茶饮料样品，准确移取10.0 mL于25 mL刻度试管中，依次准确加入300 g/L的PEG 4000溶液2.0 mL、无水硫酸钠1.0 g，混合均匀后经超声辅助至全部溶解。将上述混合溶液于40 ℃水浴20 min。待其静置分层后用长细针头的注射器吸出水相弃去。

(2)反萃取方法：向剩下的表面活性剂相中准确加入异辛烷200 μL，漩涡混合1 min，待两项分层后，移液枪吸取上层异辛烷相至自动进样小瓶的内衬管中，待测。

(3)加标回收方法：取空白茶饮料18份，分别添加低、中、高3种不同浓度(六氯苯、七氯、艾氏剂、狄氏剂4种农药的低、中、高质量浓度为0.01，0.10，1.0 μg/L，联苯菊酯、甲氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、氯氰菊酯4种农药的低、中、高质量浓度为0.02，0.20，2.0 μg/L)的标准溶液进行加标回收试验，每个加标水平重复6次。

1.2.3 色谱条件 进样口温度280 ℃；进样量1 μL，不分流进样；恒流模式，流速1 mL/min；Agilent HP-5 ms UI毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱升温程序：60 ℃保持2 min，以20 ℃/min升温至120 ℃并保持1 min，以10 ℃/min升温至250 ℃并保持3 min。

1.2.4 质谱条件 在选择性离子(SIM)模式下检测，采用电子轰击源(EI+)；电压70 eV；传输线温度150 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，溶剂延迟时间10 min。

1.2.5 数据处理 采用安捷伦Mass Hunter workstation软件进行提取保留时间和色谱峰面积，每组试验重复测定的结果以回收率和相对标准偏差，用Microsoft Office Excel 2017软件进行数据处理。使用Origin 8.0绘制谱图。

2 结果与分析

2.1 方法性能指标

配制8种农药不同浓度的系列混合标准溶液，经质谱分析，8种农药的保留时间、定性离子、定量离子(见表1)色谱峰均获得良好分离，峰形良好。标准色谱图(有机氯类农药质量浓度为1.0 mg/L的标准溶液，拟除虫菊酯类农药质量浓度为2.0 mg/L的标准溶液)如图1所示。

表1 8种农药保留时间和SIM扫描离子

1.六氯苯 2.七氯 3.艾氏剂 4.狄氏剂 5.联苯菊酯 6.甲氰菊酯 7.高效氯氟氰菊酯 8.氯氰菊酯 有机氯类农药质量浓度为1.0 mg/L 拟除虫菊酯类农药质量浓度为2.0 mg/L

2.2 浊点萃取优化

2.2.1 表面活性剂种类以及用量的选择 选择Tween-20、Triton X-100和PEG 4000 3种表面活性剂作为萃取剂时，8种农药的回收率。结果发现，Tween-20和Triton-100为萃取剂时，未能与反萃取溶剂异辛烷分层或分层不明显，无法取上层清液进样分析；PEG 4000为萃取剂时可与反萃取剂经离心有较好的分层，萃取效果好，故选用PEG 4000为萃取剂。考察不同用量的PEG 4000对回收率的影响，添加量分别设置为0.5，1.0，2.0，3.0 mL，回收率结果见图2。当PEG 4000(300 g/L)添加量为0.5～2.0 mL时，8种农药的回收率均呈上升状态，添加量为2.0～3.0 mL时，8种农药的回收率保持恒定，不再上升。因此，采用添加2 mL 300 g/L的PEG 4000进行萃取。

图2 表面活性用量的选择

2.2.2 盐种类及用量的选择 试验以无水Na2SO4为惰性盐，考察了无水Na2SO4添加量(0.5～1.2 g)对浊点萃取的影响。由图3可知：随着无水Na2SO4添加量的增加，萃取回收率增大，当无水硫酸钠添加量达到1.0 g时回收率最好，此时溶液接近饱和，再增加无水硫酸钠对回收率无影响。故试验中所用无水硫酸钠用量为1.0 g。

图3 无水硫酸钠添加量对8种农药回收率的影响

2.2.3 萃取温度及水浴平衡时间的选择 萃取过程中，较高的温度和较长的平衡时间并不会提高回收率，相反，较高的温度和较长的平衡时间会使待测物挥发、水解，从而造成损失[20]。样品经上述优化处理后，分别在20，30，40，50 ℃水浴平衡20 min。由图4可知，萃取温度为20～40 ℃时，8种农药的回收率均呈上升状态；萃取温度高于40 ℃后，8种农药的回收率均呈下降趋势。故试验采用的浊点萃取温度为40 ℃。同时研究在40 ℃水浴下不同水浴平衡时间(10，15，20，30，40 min)对回收率的影响。由图5可知，在40 ℃水浴中平衡20 min 时8种农药的回收率最好，较高的温度和较长的平衡时间并未提高回收率。

图4 温度对8种农药萃取回收率影响

图5 水浴平衡时间的选择

2.3 反萃取条件优化

表面活性剂相因其性质黏稠直接进入气质仪会造成污染，试验考虑选择正己烷、石油醚、异辛烷作为反萃取溶剂，由于正己烷和石油醚本身的挥发性较强，易挥发于超声反萃取过程中，因此重现性较差，而异辛烷与表面活性剂不互溶，提取效果好，故选择异辛烷作为反萃取剂。按上述前处理方法操作，研究异辛烷用量(100，150，200，300，500 μL)对回收率的影响，结果(见图6)表明，采用200 μL异辛烷反萃取时，回收率较高。

图6 反萃取溶剂用量的选择

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围、相关系数和方法检出限、定量限 用异辛烷将混合标准储备液逐级稀释成混合标准系列按上述优化好的CPE-GC/MS法，检测得到线性范围、线性方程、相关系数，见表2。

表2 CPE-GC/MS方法8种农药的工作曲线、线性相关系数、检出限和定量限

试验采用在空白样品中添加标准溶液按前处理后进行检测，以最低浓度的加标回收样液计算信噪比(S/N)，以S/N=3得出检出限(LOD)，S/N=10得出定量限(LOQ)。经计算，确定该方法的检出限为0.003～0.008 mg/L，定量限为0.01～0.02 mg/L。

2.4.2 加样回收率和精密度试验 吸取10.0 mL空白茶饮料18份，按照试验优化的前处理方法和色谱条件下，每个加标浓度检测6份，分别考察了低、中、高加标浓度下8种农药的回收率，结果(见表3)表明，8种农药的平均回收率为78.3%～98.4%，相对标准偏差(RSD)2.7%～8.5%，该方法的精密度和准确度均能达到满意的结果，符合农残检测方法确认的要求。

表3 3种不同加标浓度下 8种农药的回收率和相对标准偏差

2.5 与已知方法的比较

将所建立的方法与文献[3,5,9,11,20]报道的传统方法从检出限、定量限、精密度、回收率等方面进行比较，分散固相萃取、分散液液微萃取、固相萃取、QuEChERS净化等这些传统的前处理方法会使用到大量的有机溶剂，会对试验人员造成损害，对环境造成污染。与其他方法相比，研究以非离子表面活性剂作为萃取剂快速有效地提取和预浓缩分离目标物，再用微量的异辛烷进行反萃取，该方法具有操作简单，高效，富集率高，且有机溶剂用量少，整体优化了常规对茶饮料类液体饮料中农残的提取方法。传统农药残留检测及预处理方法比较见表4。

表4 与已知的农药残留测定方法的比较

2.6 实际样品的检测

采集市场上不同品牌的6个茶饮料样品按照建立的分析方法进行农药残留的测定，结果均为未检出，符合食品安全要求。

3 结论

研究通过优化表面活性剂种类及用量、盐种类及用量、萃取温度及平衡时间、反萃取溶剂种类及用量等前处理条件，建立了浊点萃取—异辛烷反萃取—气相色谱质谱法测定茶饮料中8种广泛使用的拟除虫菊酯和有机氯类农药(艾氏剂、六氯苯、氯氰菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯等)农残的技术。该方法分离效果好，具有良好的线性关系，相关系数R均大于0.995，方法的检出限为0.003～0.008 mg/kg，定量限为0.01～0.02 mg/kg，平均回收率78.3%～98.4%。与传统分散固相萃取、QuEChERS 净化等前处理方法相比，具有快速、简便、环保、高效、准确，有机溶剂用量少等特点，萃取过程中以表面活性剂水溶液代替有机试剂萃取目标分离物，微量异辛烷作为反萃取溶剂，降低试验中大量有机溶剂的加入对环境的污染及试验人员身体的损害，适用于茶饮料类液体饮品多种农药残留的测定。