固相萃取—气相色谱/质谱法同时测定咖啡干果皮中24种农药残留

刘 超 梅丽宝 尹海飞 李树珍 龙宇宙

(1.保山市质量技术监督综合检测中心，云南 保山 678000；2.中国热带农业科学院香料饮料研究所，海南 万宁 571533)

咖啡与可可、茶叶并称世界三大饮料，是仅次于石油的第二大世界贸易产品，全球咖啡及其制品的消费人数已超过15亿[1]。作为咖啡副产物的咖啡果皮，质量约占咖啡鲜果的43%～50%，每年中国咖啡生产过程中有40万t鲜果皮产生，除少量用于沤肥外，大量被丢弃[2]。目前，有关咖啡果皮的研究较多，如咖啡果皮成分研究[3-5]、咖啡果皮活性物质分析[6-9]、咖啡果皮茶[10-12]、咖啡果皮酒新产品研发[13-14]等。其中较为成熟的研究是将咖啡鲜果皮晒干后，制成干果皮泡水喝，其味道香甜，深受消费者喜爱。但是，咖啡作为农作物，种植过程中会施用农药，因此咖啡果皮农药残留问题是消费者关注的热点。而有关农药残留的检测方法主要有快速试剂盒法[15]、分光光度法[16]、色谱法[17-18]、质谱法[19-20]等。快速试剂盒法只能初步筛查样品中是否存在农药残留，不能准确定量；分光光度法只适用于部分农药残留的检测；气相色谱法对农药残留假阳性峰不能准确识别，存在误判；气相色谱—质谱法因具有分析准确、灵敏度高、线性范围宽等优点被广泛应用[21-24]，已成为当前农残检测技术的重要手段[25-26]。

针对咖啡果皮基质成分复杂：含糖类、脂肪、蛋白质、粗纤维、咖啡因、花青素、绿原酸、葫芦巴碱、生物碱等[27]，在农残检测过程中存在基质效应高、回收率低、检测结果不准确的问题。研究拟通过优化提取溶剂、控制洗脱溶剂极性、选择合适的固相萃取净化填料，建立固相萃取净化技术—气相色谱/质谱法同时测定咖啡干果皮中24种农药残留的方法，为咖啡干果皮中多种农药残留的检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

咖啡干果皮：采自云南省保山市、普洱市、临沧市、德宏州，共12份样品，常温密封贮藏；

农药标准物质(敌敌畏、甲胺磷、异丙威、灭线磷、甲拌磷、二嗪磷、氯唑磷、久效磷、甲基毒死蜱、毒死蜱、甲基对硫磷、倍硫磷、马拉硫磷、杀螟硫磷、对硫磷、二甲戊灵、喹硫磷、水胺硫磷、三唑醇、杀扑磷、溴虫腈、丙环唑、三唑磷、戊唑醇、环氧七氯)：质量浓度为100 μg/mL，1.2 mL/支，坛墨质检—标准物质中心；

正己烷、乙腈、丙酮、甲苯：色谱纯，美国Supelco公司；

水：UP超纯水，实验室自制；

ProElut Florisil固相萃取小柱：500 mg/6 mL，迪马科技有限公司；

Mega BE Carb/NH2固相萃取小柱：500 mg/6 mL，美国Agilent Technologies公司；

ProElut TPC固相萃取小柱：3 g/12 mL，迪马科技有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

气相色谱—质谱联用仪：7890A-5975C型，配有EI电子轰击离子源，美国Agilent Technologies公司；

石英毛细管色谱柱：ZB-1701型，30 m×0.25 mm×0.25 μm，广州菲罗门科学仪器有限公司；

电子分析天平：MS205DΜ型，瑞士Mettler Toledo公司；

超声仪：AS3120型，北京华瑞博远科技发展有限公司；

氮吹浓缩装置：MTN-2800W型，天津奥特赛恩斯仪器有限公司；

旋转蒸发仪：RE-3000型，上海亚荣生化仪器厂；

离心机：TDL-40B型，上海安亭科学仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 混合标准工作溶液的配制

(1)混合标准储备液：以丙酮为溶剂，依次吸取24种农药标准物质各1.00 mL于25.00 mL棕色容量瓶中，定容，摇匀，配制成质量浓度为4.00 μg/mL的储备液。

(2)内标溶液：准确移取质量浓度为100 μg/mL的环氧七氯标准溶液1.00 mL，用丙酮定容至2.00 mL，配成质量浓度为50.00 μg/mL的内标溶液。

(3)混合标准工作液：分别移取0.00，0.20，0.50，1.00，2.50，5.00 mL混合标准储备液于10.00 mL棕色容量瓶中，用空白基质溶液定容，配制成质量浓度分别为0.00，0.08，0.20，0.40，1.00，2.00 μg/mL的标准工作液，移取1.00 mL于1.5 mL进样瓶中，加入20 μL内标溶液，使内标浓度为1.00 μg/mL。

1.2.2 试样的制备 取咖啡干果皮400 g，按四分法取样，粉碎，过0.22 mm孔径筛网。

1.2.3 试样的提取 称取5.00 g试样于50 mL塑料离心管中，加3.0 mL水润湿，加入20 μL内标和30 mL乙腈，盖紧塞子，超声提取30 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液，加入20 mL乙腈，重复上述操作，合并离心液于150 mL鸡心瓶中，45 ℃水浴减压蒸发近干，加入2.0 mL丙酮溶解，待净化。

1.2.4 试样的净化 将ProElut TPC固相萃取小柱安装于固相萃取装置上，用5.0 mL乙腈—甲苯(V乙腈∶V甲苯=3∶1)预淋洗小柱，待淋洗液到达吸附层表面时，将浓缩液转移至固相萃取柱中，下接10 mL比色管，用10 mL洗脱液洗脱，控制流速为2～3 mL/min，收集洗脱液于10 mL 比色管中，45 ℃水浴氮吹浓缩近干，用1.0 mL丙酮溶解，定容，过0.22 μm尼龙滤头，供气相色谱—质谱联用仪测定。

1.2.5 分析条件

(1)色谱条件：升温程序为80 ℃保持1 min，以20 ℃/min升至200 ℃，保持7 min，以20 ℃/min升温至265 ℃，保持10 min；载气(He)流速1.0 mL/min，压力70.3 kPa，进样口温度260 ℃，进样量1.0 μL，不分流进样。

(2)质谱条件：电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度200 ℃；选择离子(SIM)监测模式；扫描时间5～28 min。

1.2.6 方法的定量限、回收率和精密度测定 取咖啡干果皮空白样品，按试验方法处理后，测定被测样品信号强度S与噪音强度N，按S/N=10计算定量限；另取两份咖啡干果皮空白样品，分别在0.03，0.30 mg/kg水平进行加标试验，重复测定6次，计算加标回收率和日内精密度，同时取相同含量的对照品，连续监测6 d，计算方法的日间精密度。

1.2.7 试验分析 依次准确吸取1.0 μL标准工作液及处理后的样品溶液注入气相色谱—质谱联用仪(GC-MS)，以保留时间和离子丰度比定性，以峰面积内标法定量。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

查阅相关资料[28-30]，农药残留检测常用的提取溶剂有石油醚、丙酮、乙腈。石油醚作为提取溶剂时，主要用于油脂含量高、极性小的有机氯类农药化合物的提取，如GB/T 5009.19—2008《食品中有机氯农药多组分残留量的测定》，对极性较大的农残化合物提取效率低。丙酮作为提取溶剂，适用于大多数农残的提取，特别是极性较大的有机磷类农药的提取，如GB/T 5009.20—2003《食品中有机磷农药残留量的测定》，但丙酮在提取过程中，植物组织中的油脂和色素也会被提取出来，严重影响后续的净化处理[31]。乙腈作提取剂时，提取效率高、溶出杂质少、后处理简便[32]。因此，选择乙腈作为提取溶剂。

2.2 洗脱溶剂和固相萃取小柱的选择

3种不同的洗脱溶剂[正己烷—丙酮(V正己烷∶V丙酮=9∶1)、丙酮、乙腈—甲苯(V乙腈∶V甲苯=3∶1)]对3种不同填料固相萃取小柱(ProElut Florisil固相萃取小柱、Mega BE Carb/NH2固相萃取小柱、ProElut TPC固相萃取小柱)中农残的洗脱效率见表1。

由表1可知，吸附于ProElut Florisil固相萃取小柱中的农药残留洗脱效果为乙腈—甲苯>丙酮>正己烷—丙酮；吸附于Mega BE Carb/NH2固相萃取小柱中的农药残留洗脱效果为乙腈—甲苯>丙酮>正己烷—丙酮；吸附于ProElut TPC固相萃取小柱中的农药残留洗脱效果为乙腈—甲苯>丙酮>正己烷—丙酮，说明选取正己烷—丙酮和丙酮作为洗脱溶剂时，24种农药洗脱效率值均低于乙腈—甲苯溶液，同时误差也最大。当用正己烷—丙酮作洗脱溶剂时，吸附在ProElut Florisil固相萃取小柱和Mega BE Carb/NH2固相萃取小柱上的敌敌畏、甲拌磷较难被洗脱。由图1可知，敌敌畏、甲拌磷在GC-MS中的响应值非常低，主要与农药的结构及洗脱溶剂的极性有关，而被检测的农药多为有机磷类和杂环类结构，极性大，依据相似相溶原理，当用极性较低的溶剂正己烷—丙酮和丙酮时，极性大的农药化合物较难被洗脱，当增大极性，用乙腈—甲苯洗脱时，被检测的农药化合物较易被洗脱。

图1 24种农残标准溶液(1.00 μg/mL)在不同固相萃取小柱和洗脱溶剂中选择离子流色谱图

表1 农药标准物质在不同固相萃取小柱和洗脱溶剂下的洗脱效率

在正己烷—丙酮(V正己烷∶V丙酮=9∶1)洗脱溶剂体系下，3种固相萃取小柱的净化效果为ProElut TPC固相萃取小柱>ProElut Florisil固相萃取小柱>Mega BE Carb/NH2固相萃取小柱；在丙酮洗脱溶剂体系下，3种固相萃取小柱的洗脱效果为ProElut TPC固相萃取小柱>ProElut Florisil固相萃取小柱>Mega BE Carb/NH2固相萃取小柱；在乙腈—甲苯(V乙腈∶V甲苯=3∶1)洗脱溶剂体系下，3种固相萃取小柱的洗脱效果为ProElut TPC固相萃取小柱>Mega BE Carb/NH2>固相萃取小柱ProElut Florisil固相萃取小柱。3种固相萃取小柱的洗脱净化效率存在差异，主要与固相萃取小柱的填充材料有关，Florisil固相萃取小柱以无机材料弗罗里硅藻土(MgO·SiO2)为主，是一种高选择性能的吸附剂，主要吸附油脂、烃类含氮化合物及色素；Mega BECarb/NH2固相萃取小柱以石墨化碳(CARB)和氨基(NH2)为主，主要通过离子交换和极性吸附达到保留的作用；ProElut TPC固相萃取小柱是以高聚物PAS、石墨化碳(CARB)和硫酸镁为主，是与NH2相似的吸附柱，但具有比NH2更强的离子交换能力，可用于去除农残分析中的金属离子、有机酸、色素和酚类物质。24种农残在ProElut TPC固相萃取小柱上的吸附效率最低，经GC-MS检测，目标峰最多，其次为ProElut Florisil固相萃取小柱，吸附最大的为Mega BE Carb/NH2固相萃取小柱。

综上，选择乙腈—甲苯(V乙腈∶V甲苯=3∶1)作为洗脱溶剂，ProElut TPC固相萃取小柱作为净化柱。

2.3 分析条件的优化

以两相邻色谱峰分离度≥1.5为原则，优化气相色谱条件，通过全扫描获得混合标准农药总离子流图(TIC)，根据总离子流图中目标化合物的保留时间和质荷比(m/z)，确定选择离子扫描(SIM)模式下的分析条件，24种农药残留的保留时间、定性离子、定量离子及丰度比见表2。

表2 24种农药保留时间、定量和定性离子、线性方程等相关参数表

2.4 校准曲线及其相关性

由图2可知，24种农药在28 min内得到较好分离，各农药在质量浓度为0.016～0.400 mg/kg时线性关系良好，其相关系数为0.997 9～0.999 9，符合GB/T 27417—2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》定量分析要求。

1.敌敌畏 2.甲胺磷 3.异丙威 4.灭线磷 5.甲拌磷 6.二嗪磷 7.氯唑磷 8.久效磷 9.甲基毒死蜱 10.毒死蜱 11.甲基对硫磷 12.倍硫磷 13.马拉硫磷 14.杀螟硫磷 15.环氧七氯(内标) 16.对硫磷 17.二甲戊灵 18.喹硫磷 19.水胺硫磷 20.三唑醇 21.杀扑磷 22.溴虫腈 23.丙环唑 24.三唑磷 25.戊唑醇

2.5 方法的定量限、回收率和精密度

由表3可知，24种农药残留的方法定量限为0.01～0.03 mg/kg；0.03 mg/kg加标水平下，回收率为65.2%～108.5%，日内精密度相对标准偏差(RSD)为3.7%～6.8%，日间精密度相对标准偏差为4.2%～7.2%；0.30 mg/kg 加标水平下，回收率为81.4%～105.7%，日内精密度相对标准偏差为2.5%～5.9%，日间精密度相对标准偏差为2.8%～6.4%，符合GB/T 27417—2017《合格评定 化学分析方法确认和验证指南》要求。

表3 0.03，0.30 mg/kg加标水平下24种农药残留的定量限、回收率和精密度

2.6 实际样品分析

运用建立的方法对保山市、普洱市、临沧市、德宏州4个咖啡主产区的12份咖啡干果皮样品进行农药残留检测，结果表明：2份样品检出毒死蜱，含量分别为0.041，0.037 mg/kg；1份样品检出戊唑醇，含量为0.058 mg/kg，为了进一步验证方法的准确性，将检测出毒死蜱和戊唑醇的样品进液相色谱—质谱/质谱联用仪分析确证，结果一致。依据GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》进行判定，均未超出标准要求；其余样品均未检出，说明云南咖啡果皮农药残留安全状况总体良好。

3 结论

建立了一种同时分析咖啡干果皮中24种农药残留的固相萃取—气相色谱/质谱方法。该方法各性能参数经验证均满足国家标准要求，测定结果准确、可靠，能够运用于咖啡果皮中多组分农药残留的定性和定量分析。当选用乙腈—甲苯(V乙腈∶V甲苯=3∶1)作洗脱溶剂、ProElut TPC固相萃取小柱作净化柱时，净化和洗脱效均最高，效率为95%。从农药残留检出情况看，12批次样品中，3批次样品检出农药残留，依据GB 2763—2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》判定，均未超出标准要求值，表明咖啡干果皮农残安全性较高。同时，由于此次采集的样品数量有限，在农残检测数据充分性上还有待完善，后续将加大对云南各咖啡主产区咖啡果皮农药残留的监测力度，以便更加准确、客观、科学、全面地评价云南咖啡果皮农药残留状况。