自噬相关信号通路调控骨相关疾病发生发展的作用机制研究进展

秦庆庆，谢犇 ，王一坤，阳庆林，杨杜斌，王勇平

1 兰州大学第一临床医学院，兰州 730000；2 兰州大学第一医院骨科

自噬是在各种应激条件下诱导的细胞高度保守的分解代谢过程，可防止细胞损伤并在能量或营养缺乏的情况下促进细胞存活，对各种细胞毒性损伤做出反应，并且可以调控细胞的生长及分化［1］。自噬可通过相关信号通路调控成骨细胞、软骨细胞、骨髓间充质干细胞（BMSCs）和破骨细胞的增殖、分化等生物学行为，在骨相关疾病的发生发展中发挥重要的调控作用。现就自噬相关信号通路通过调控成骨细胞、软骨细胞、BMSCs、破骨细胞生物学行为在骨相关疾病发生发展中的作用作一综述，旨在为骨相关疾病的基础研究提供借鉴。

1 自噬相关信号通路通过调控成骨细胞生物学行为作用于骨相关疾病发生发展

成骨细胞源自间充质干细胞的单核细胞，在初始骨形成和后期骨重塑期间负责骨的增殖、合成和矿化。成骨细胞通过增殖、分化和矿化三个过程主导骨的形成，该过程受到严格调控，若调控异常会导致骨质疏松、骨不愈合等疾病发生。研究表明，自噬可通过磷酸酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、mTOR、核因子κB（NF-κB）、Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）等信号通路调控成骨细胞增殖、分化、矿化等生物学行为，在骨相关疾病中发挥关键性作用。

1.1 PI3K/Akt/mTOR信号通路 PI3K/Akt/mTOR是经典自噬信号通路之一，该通路主要由转导通路PI3K/Akt和效应分子mTOR组成，PI3K分子参与细胞的活性、生长、分化过程，并可调节细胞内蛋白分子的活性。Akt作为PI3K的下游效应分子，位于PI3K/Akt/mTOR信号通路的中间位置，起到承接作用。活化后，磷酸化的Akt分子可以影响下游多个效应分子的活性，从而影响整个细胞周期、蛋白质合成和自噬过程。最下游的效应分子mTOR是Akt的重要底物，可以收到各种信号并做出应答，因此，mTOR在该信号传导通路中充当“集合点”的作用［2］。研究显示，PI3K/Akt/mTOR信号通路是自噬抑制通路，该通路激活后可抑制自噬，保护细胞免于凋亡；相反，抑制该通路会诱导自噬并使细胞进入凋亡过程［3］。

TANG等［4］研究发现，雷帕霉素（RAP）和β-蜕皮甾酮均能显著提高骨折患者成骨细胞碱性磷酸酶（ALP）活性和骨细胞特异转录因子RunX2的表达，抑制细胞凋亡率；且可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导成骨细胞自噬，促进骨折愈合。Beclin-1、LC3、p62以及自噬相关基因（ATG）是常用的自噬标志物，YANG等［5］报道，用白藜芦醇治疗骨质疏松大鼠可显著改善大鼠骨质，降低大鼠血清ALP和骨钙素水平；此外，在接受大剂量白藜芦醇治疗的骨质疏松症大鼠中，沉默信息调控因子1（SIRT1）、LC3及Beclin-1表达增加，磷酸化Akt（p-Akt）及p-mTOR下调，提示白藜芦醇可能通过介导SIRT1和PI3K/Akt/mTOR信号通路增强线粒体自噬，从而保护骨质疏松大鼠的成骨细胞。

1.2 mTOR信号通路 mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶（PIKK）家族，含有mTORC1和mTORC2两种复合体。RAP敏感的mTORC1能够通过调控信号通路从而决定细胞的大小；RAP不敏感的mTORC2能够控制肌动蛋白细胞骨架，从而决定细胞的形状。mTOR通路受到多种细胞信号的调控，同时也可作为调控其他信号通路的上游分子，参与细胞生长和代谢过程。

WANG等［6］发现知母皂苷BⅡ减弱了糖尿病大鼠胫骨微结构的恶化，并以剂量依赖性的方式减少了大鼠钙质原发性成骨细胞中高血糖诱导的细胞凋亡，部分恢复了因高糖所致的自噬通量受损；体内结果表明，口服知母皂苷BⅡ下调了糖尿病大鼠近端胫骨中mTOR和NF-κB的磷酸化，上调了Beclin-1的表达。这提示知母皂苷BⅡ可通过抑制mTOR/NF-κB信号通路来减轻高糖诱导的氧化应激和细胞凋亡，从而改善高血糖所致骨质疏松。AL SAEDI等［7］将正常人成骨细胞和RAP放入存在脂毒性浓度的棕榈酸（PA）培养，发现RAP减少了PA诱导的细胞凋亡，而且自噬体形成显著增加。WANG等［8］发现分散的纳米羟基磷灰石（HAP）以剂量依赖性方式促进成骨细胞分化；内化的纳米HAP颗粒位于典型的自噬液泡中，并增加了LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例，提示HAP通过mTOR信号通路介导自噬，并以剂量依赖的方式调节成骨细胞的分化。RUOLAN等［9］研究发现，硅酸盐纳米颗粒通过激活mTOR/ULK1诱导自噬，随后触发Wnt/β-catenin通路，促进成骨细胞的分化和矿化。

1.3 NF-κB信号通路 NF-κB是一种核转录因子，其可与某些基因启动子区固定的核苷酸序列结合，具有启动基因转录的功能。同时，NF-κB是体内调控细胞的增殖、分化、炎症过程中的重要转录因子，其能够参与机体的炎症反应、免疫应答及其他应激反应。XU等［10］通过对照实验及细胞自噬实验发现，低浓度脂多糖（LPS）通过NF-κB信号通路激活成骨细胞自噬，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，促进骨折愈合。QIN等［11］通过检测LC3蛋白表达及细胞自噬发现，成骨细胞本身具有较强的自噬作用，而适当浓度的SN50对成骨细胞NF-κB通路的阻断与自噬的明显抑制有关。ZHENG等［12］采用CCK-8、透射电镜和流式细胞术评估成骨细胞增殖、自噬和凋亡，发现与正常骨组织比较，股骨头缺血性坏死（ANFH）骨组织中TNF-α的表达明显上调，显著促进了成骨细胞的自噬和凋亡，且p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）/NF-κB信号通路被活化；此外，通过抑制剂阻断该通路，可抑制自噬，促进TNF-α诱导的细胞凋亡。

1.4 Wnt/β-catenin信号通路 Wnt/β-catenin是一条比较经典的信号通路，β-catenin是检测Wnt是否激活的一个重要生物标志物。在跨膜受体FZD蛋白家族接收Wnt信号后，可通过下游蛋白激酶的磷酸化作用抑制β-catenin的降解活性，随后胞质中稳定积累的β-catenin进入细胞核后结合TCF/LEF转录因子家族，启动下游靶基因的转录。CHEN等［13］发现TNF-α抑制成骨分化，且下调了LC3Ⅱ、ATG7和Beclin-1的表达，提示自噬在成骨分化过程中受到抑制；Wnt/β-catenin信号通路成员如低密度脂蛋白受体相关蛋白5（LRP5）、β-catenin和磷酸化β-catenin表达也相应降低；此外，TNF-α对成骨分化和Wnt/β-catenin信号通路的抑制作用可被自噬诱导剂减弱，而自噬抑制剂可加剧该抑制作用。这提示TNF-α通过Wnt/β-catenin信号通路抑制自噬，从而抑制成骨细胞分化，而自噬正向调节Wnt/β -catenin通路。RUOLAN 等［9］研究发现，硅酸钙（C2SNPs）可显著促进LC3和Beclin-1的表达，而下调自噬底物P62表达，而这些效应可被自噬抑制剂3-MA部分逆转；进一步分析发现C2SNPs可以通过抑制mTOR和促进ULK1表达来激活自噬，自噬进一步激活β-catenin表达。这提示C2SNPs可通过激活mTOR/ULK1信号通路诱导自噬，随后触发Wnt/β-catenin通路，从而促进成骨细胞的分化和矿化。

2 自噬相关信号通路通过调控软骨细胞生物学行为作用于骨相关疾病发生发展

软骨膜细胞通过软骨内化骨，在生长的软骨基质中形成软骨细胞。软骨细胞的分化成熟过程受到多种信号因子和通路的严格调控。研究表明，自噬相关基因在软骨细胞活性及分化等方面发挥关键性的调控作用，同时自噬还可通过相关信号通路来调控软骨细胞的生物学行为。目前，已知与软骨细胞自噬相关的信号通路主要集中在PI3K/Akt/mTOR信号通路、AMPK信号通路、NF-κB信号通路、ERK信号通路等。

2.1 PI3K/Akt/mTOR信号通路 PI3K/Akt信号通路具有促进软骨细胞增殖并抑制自噬的作用，激活Akt可以通过磷酸化mTOR调节软骨细胞存活、自噬与凋亡，介导软骨组织损伤过程。MA等［14］研究发现，氟化钠（NaF）抑制了小鼠胫骨中增殖细胞核抗原（PCNA）和pS6的蛋白表达并下调小鼠ATDC5软骨形成细胞系中mTOR信号通路相关基因（PI3K、Akt、mTOR、4EBP1、S6K1）表达；NaF处理后，自噬相关基因LC3、Beclin-1、p62的mRNA和蛋白水平发生显著变化。MHY1485是一种小分子mTOR激活剂，其可完全逆转NaF诱导的自噬，且恢复ATDC5细胞中NaF诱导的增殖软骨细胞标志物Sox9和Ⅱ型胶原蛋白的下调。该研究表明氟化物能够通过PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制软骨形成中的增殖并促进自噬，从而导致氟骨症。XU等［15］通过建立大鼠OA模型发现，SIRT3过表达可抑制IL-1β诱导的炎症、细胞凋亡、线粒体功能障碍和软骨细胞变性，而沉默SIRT3可以得到相反的结果；并且SIRT3过表达可以恢复IL-1β诱导的自噬抑制。此外，该研究还发现IL-1β诱导的PI3K/Akt/mTOR信号通路激活被SIRT3过表达抑制，关节内SIRT3过表达减轻了OA诱导的大鼠关节损伤。这提示SIRT3可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路激活自噬，从而减轻了OA大鼠关节损伤。

2.2 腺苷单磷酸激活的蛋白激酶（AMPK）/mTOR信号通路 AMPK作为一种重要的生理能量传感器，是细胞和有机体能量平衡的主要调节因子，协调多种代谢途径，平衡能量的供需，从而调节细胞和器官的生长。能量代谢平衡调控是由多种相关的信号通路介导的，其中AMPK/mTOR信号通路在细胞内共同构成一个合成代谢和分解代谢过程的开关。同时，AMPK/mTOR也是自噬的重要调控通路，在软骨细胞的分化、生长和凋亡中起着重要的作用。

MEI等［16］将 ATDC5 软骨细胞用不同浓度的17β-雌二醇（17β-E2）处理，发现 17β-E2增加了SIRT1、p-AMPK和线粒体自噬相关蛋白的表达水平，但降低了p-mTOR的表达。这表明17β-E2能够通过SIRT1介导的AMPK/mTOR信号通路诱导线粒体自噬，次那个保护软骨细胞，可以用于防治绝经后骨关节炎。ZHAO等［17］用IL-1β刺激原代软骨细胞模拟OA软骨细胞模型，用臭氧处理后发现，臭氧改善了IL-1β刺激软骨细胞的细胞活力、抑制了细胞中IL-6和TNF-α的mRNA表达水平并激活AMPK/mTOR信号通路，改善了细胞自噬水平的降低。这提示臭氧可通过激活AMPK/mTOR信号通路，改善IL-1β刺激软骨细胞自噬水平的降低，抑制炎症反应，有助于维持细胞的代谢平衡。QIN等［18］研究表明，白藜芦醇关节内注射部分途径是通过平衡HIF-1α和HIF-2α的表达，从而调节AMPK/mTOR信号通路，促进软骨细胞自噬而延缓关节软骨变性。

2.3 NF-κB信号通路 研究表明，NF-κB能够调控软骨细胞的增殖、分化和凋亡，在骨发育和常见的骨疾病中发挥重要作用。LIU等［19］研究发现，RAP可通过激活自噬抑制炎症分解代谢基因的过表达，并可抑制软骨细胞内NF-κB信号通路，打破炎症因子与炎症因子的正反馈回路，降低炎症进展速率和水平，延缓炎症对软骨的破坏。MI等［20］发现，TNF-α诱导软骨细胞中IL-1、IL-6、活性氧、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和Caspase-9的产生，抑制自噬标志物ATG5，ATG7的产生，阻止LC3Ⅰ转化为LC3Ⅱ并诱导基质金属蛋白酶3（MMP-3）及MMP-9表达，而这些影响可以通过淫羊藿苷或NF-κB抑制剂PDTC治疗来部分阻断，提示淫羊藿苷通过抑制NF-κB通路激活软骨细胞自噬，抑制炎症细胞因子和细胞凋亡，从而对OA发挥保护作用。JIANG等［21］研究显示，双氢青蒿素（DHA）增加软骨细胞中的LC3-Ⅱ、ATG5水平及自噬体数量，抑制TNF-α诱导的MMP-3、MMP-9表达；TNF-α刺激的核易位、p65和IκBα蛋白的降解分别在DHA处理的软骨细胞中减弱；而NF-κB抑制激活了TNF-α处理的软骨细胞自噬。这提示DHA可能通过抑制NF-κB通路促进软骨细胞自噬，从而抑制软骨细胞分解代谢和炎症因子的水平。

2.4 胞外信号调节激酶（ERK）信号通路 ERK包括ERK1及ERK2，参与细胞增殖与分化，是蛋白激酶信号转导通路家族成员之一，刺激通过ERK信号转导通路传至细胞核内，在软骨细胞的增殖和自噬方面发挥关键性作用。

刘敏等［22］研究发现，过表达雌激素受体1（ESR1）能够促进雌二醇（E2）处理后软骨细胞LC3及ATG7表达，降低细胞内p-ERK水平；而干扰ESR1表达后，自噬相关蛋白表达减少，凋亡蛋白表达增加，增殖标志基因表达下调，细胞内p-ERK水平相对增加。通过特异性抑制剂阻断ERK活化，可抑制E2/ESR1诱导的自噬增加及凋亡减少，抑制增殖相关基因表达。这提示E2与ESR1的靶向结合可能通过抑制ERK信号通路的激活促进细胞自噬，诱导细胞凋亡，从而促进体外人软骨细胞增殖。GE等［23］将小鼠特异性AMPKα双敲除（AMPKα cDKO）并对小鼠行卵巢切除术（OVX），建立OA模型，发现在OVX AMPK cDKO小鼠关节软骨中LC3水平降低、p70S6K磷酸化增加，而使用17β-雌二醇刺激可导致LC3转化率增加、p70S6K磷酸化水平降低；但17β-雌二醇的作用通过阻断ERK信号通路而被消除，这提示雌激素可通过ERK信号通路促进软骨细胞自噬，从而保护OA发展过程中的关节软骨。LI等［24］发现，姜黄素可以增加软骨细胞中磷酸化细胞ERK1/2、LC3-Ⅱ及Beclin-1的表达，将软骨细胞与ERK1/2抑制剂U0126共同培养后，自噬标志物的表达降低，提示姜黄可能通过作用于ERK1/2诱导的软骨细胞自噬来抑制细胞凋亡和炎症信号传导。

3 自噬相关信号通路通过调控BMSCs生物学行为作用于骨相关疾病发生发展

BMSCs是哺乳动物骨髓基质中发现的能够分化产生软骨、骨、脂肪、成肌细胞、神经的细胞群，其有多种类型，具有自我更新和多向分化的潜力。在不同条件下，BMSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞以及神经细胞等多种类型的组织细胞，骨组织发育、骨代谢和骨修复均需要BMSCs的参与。BMSCs的自噬可影响其分化过程，进而影响骨量。目前已知与BMSCs自噬相关的信号通路主要有PI3K/Akt/mTOR信号通路、AMPK/mTOR信号通路、mTOR信号通路等。

3.1 PI3K/Akt/mTOR信号通路 PI3K/Akt/mTOR信号通路可以通过调控自噬来调节BMSCs的成骨分化。ZHAO等［25］发现，益母草处理的SD大鼠BMSCs中ATG5、ATG7和LC3的mRNA和蛋白水平均上调，且益母草部分恢复了自噬抑制剂3-MA对大鼠BMSCs自噬的抑制作用。此外，在益母草处理后，大鼠BMSCs中PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活，提示益母草通过PI3K/Akt/mTOR信号通路激活自噬，促进大鼠BMSCs成骨分化。LI等［26］研究发现，自噬参与了Ⅰ型神经纤维瘤病基因（NF1）调节的BMSCs成骨分化，且NF1可能通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控BMSCs的自噬。除PI3K作为上游分子调控Akt/mTOR外，DENG等［27］研究发现，缺氧可通过肌醇焦磷酸盐（IP7）介导的Akt/mTOR信号通路促进BMSCs自噬和凋亡。

3.2 AMPK/mTOR信号通路 AMPK/mTOR信号通路在BMSCs的分化中起着重要作用，可调控BMSCs的自噬和凋亡。WANG等［28］用不同浓度的川芎嗪（TMP）处理BMSCs，并将其暴露于地塞米松（Dex）中48 h，发现TMP抑制Dex诱导的细胞毒性和保护BMSCs的凋亡，且TMP通过AMPK和mTOR途径促进自噬，保护BMSCs。ZHANG等［29］研究发现，低氧应激增加了BMSCs的自噬和凋亡并呈时间依赖性，同时增加了AMPK/mTOR信号通路的活性；此外，自噬抑制剂3-MA可抑制低氧诱导的BMSCs凋亡，而自噬激活剂RAPA可加重低氧诱导的BMSCs凋亡；提示缺氧通过AMPK/mTOR信号通路调控BMSCs的凋亡和自噬。

3.3 mTOR信号通路 张样聪等［30］研究发现，氯化镉（CdCl2）能够抑制人BMSCs成骨分化，其机制可能是通过上调11β-羟基类固醇脱氢酶1（11β-HSD1）、抑制mTOR信号通路并激活自噬实现的，提示CdCl2可能通过mTOR信号通路激活自噬，从而抑制成骨分化。RUOLAN 等［9］研究发现，C2SNPs能够通过激活mTOR/ULK1信号通路诱导自噬，随后触发Wnt/β-catenin信号通路，促进BMSCs成骨细胞的分化。

4 自噬相关信号通路通过调控破骨细胞生物学行为作用于骨相关疾病发生发展

破骨细胞起源于骨髓单核髓性造血干细胞，是人体惟一的骨吸收细胞，在骨代谢平衡中具有重要作用。破骨细胞动员和分化成熟过程是一个复杂而又精细的多级调控过程，受到多种信号因子和通路的影响。自噬相关基因在破骨细胞的活性、分化等方面发挥关键性的调控作用，同时自噬还可通过相关信号通路来调控破骨细胞的生物学活性。目前已知与破骨细胞自噬相关通路主要由PI3K/Akt/mTOR信号通路、NF-κB信号通路、AMPK信号通路等。

4.1 PI3K/Akt/mTOR信号通路 MA等［31］研究发现，在NF-κB受体活化因子配体（RANKL）诱导的破骨细胞分化过程中，胱硫醚b合酶（CBS）和胱硫醚c裂解酶（CSE）表达增加，硫化氢（H2S）促进RANKL诱导的破骨细胞生成，抑制成熟破骨细胞凋亡；其机制为H2S抑制Raw264.7细胞自噬并活化PI3K/Akt/mTOR信号通路，自噬激活剂RAPA能够减轻H2S对破骨细胞分化的诱导。这提示H2S可以通过激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制自噬，促进破骨细胞的形成。FU等［32］通过Dex诱导小鼠骨质疏松发现，Dex处理的小鼠骨小梁显微结构恶化，破骨细胞数量和扩散面积增加，自噬体数量增加，自噬相关蛋白水平上调。此外，在Dex处理下原代培养的破骨细胞中Beclin-1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、ATG1、ATG13和ATG7水平增加；而原代培养的破骨细胞中PI3K、p-Akt和pmTOR表达受到抑制，使用选择性PTEN抑制剂SF1670可激活PI3K/Akt/mTOR信号传导途径，逆转Dex处理下的破骨细胞自噬。这提示糖皮质激素通过PI3K/Akt/mTOR信号通路增强破骨细胞自噬，造成骨量的丢失。

4.2 NF-κB信号通路 NF-κB信号通路可通过激活自噬抑制破骨细胞形成及细胞活性。CHU等［33］发现，在体外实验中，黄酮素（Nepetin）能有效抑制RANKL诱导的破骨细胞分化、形成和骨吸收；体内实验中，Nepetin能保护小鼠颅骨免受钛颗粒诱导的骨溶解；机制上，Nepetin抑制了RANKL诱导的NF-κB和MAPK信号通路的激活以及Beclin-1泛素化。这提示Nepetin通过抑制RANKL诱导的NF-κB和MAPK信号通路激活以及自噬来抑制破骨细胞的形成。LIU等［34］研究发现，异甘草素（ISL）能够抑制RANKL诱导的破骨细胞生成，且抑制LC3Ⅱ和Beclin-1表达，而RAPA激活自噬逆转了ISL诱导的抗破骨细胞作用。ISL抑制了RANKL诱导的NF-κB表达和核转位，而NF-κB抑制剂Bay 11-7082显著抑制了RANKL诱导的自噬激活，提示ISL可能通过抑制NF-κB依赖的自噬通路起到抗破骨细胞活性的作用。

综上所述，自噬相关的PI3K/Akt/mTOR、mTOR、NF-κB、AMPK等信号通路在调控成骨细胞、软骨细胞、BMSCs和破骨细胞的分化及活性方面有着非常重要的作用。而各种信号通路并非完全相互独立，他们通过细胞因子、蛋白质等物质相互连接形成复杂的调控网络，交错相织。鉴于这些研究，可以应用有关药物来激活或抑制上述信号通路从而治疗或阻断常见骨疾病的发生。然而，到目前为止，应用于临床治疗的相关药物的开发、使用有限，因此，需要对这些机制进行深入的研究，从而为临床治疗相关骨疾病提供理论依据。