胱天蛋白酶募集域蛋白9介导心肌缺血再灌注损伤发生发展的机制研究进展

张智禄，何新雨，彭瑜，张钲

1 兰州大学第一临床医学院，兰州 730000；2 兰州大学第一医院心内科

随着社会经济的发展及人口老龄化的不断加速，心血管疾病的发病率和病死率不断增高，其中急性心肌梗死（AMI）因起病急且病情变化快成为患者死亡的主要原因。经皮冠状动脉介入治疗虽然可以有效恢复冠状动脉血流，但AMI患者1年内再发心肌梗死率为2.5%，早期再发心肌梗死患者1年病死率达53.5%［1］。AMI患者较差的预后与心肌缺血再灌注损伤（MIRI）密切相关，闭塞血管重新开放的同时加剧了心肌细胞的代谢失调，导致缺血心肌细胞不可逆死亡的增加及梗死区扩大，这被称为无复流现象，目前尚无有效的治疗方法［2］。MIRI的发生涉及多种复杂的病理生理过程，如炎症反应、细胞凋亡及自噬、钙超载及氧化应激等［3］。胱天蛋白酶募集域蛋白9（CARD9）主要表达于骨髓细胞，此外在巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞等抗原呈递细胞中也有表达［4］，其由定位于人类9q34.3的基因编码，包含2个功能区，即位于N端的CARD结构域和位于C端的具有450个氨基酸的卷曲螺旋结构域，前者具有胱天蛋白酶募集功能，后者主要介导蛋白质寡聚化作用［5］。生理状态下，CARD9在细胞内与其他含有CARD结构域的蛋白质相互作用，实现细胞内信号转导，启动哺乳动物针对特定真菌、细菌和病毒的先天免疫反应及适应性免疫，调节机体炎症及免疫反应［6-7］。但是在缺血、缺氧等病理状态下，CARD9可被异常激活，导致机体免疫系统功能紊乱，从而引发炎症性疾病或某些肿瘤的发生［8］。越来越多的研究显示，CARD9可以在心血管疾病中调控p38 MAPK、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎症小体及核因子κB（NF-κB）的激活［9］，而这些炎症因子能够通过介导心肌细胞炎症反应、凋亡及自噬的方式作用于MIRI的病理生理过程，参与MIRI的发生发展。现就CARD9介导MIRI的机制作一综述，以期为MIRI的治疗提供新思路。

1 CARD9通过调控心肌细胞炎症反应介导MIRI发生发展

炎症反应是MIRI的重要环节，当MIRI发生时，固有免疫应答立即被激活，造成过度的急性炎症反应，从而导致免疫细胞浸润、活性氧分泌及血管内皮损伤，进一步加重心肌组织损伤［10］。

1.1 通过激活p38 MAPK调控心肌细胞炎症反应先天免疫反应与MIRI具有一定的因果关系，CARD9作为先天免疫反应的重要调节蛋白，能够通过介导p38 MAPK激活调控促炎细胞因子和趋化因子的转录和产生［11］。在肥胖小鼠模型中，小鼠心脏组织CARD9表达及p38 MAPK的磷酸化激活均显著增加，而敲除CARD9不仅会下调小鼠心脏组织中p38 MAPK的活性，并且可减少小鼠心脏中浸润的巨噬细胞数量及心肌、血浆和巨噬细胞衍生的炎症细胞因子表达，如白细胞介素6（IL-6）、IL-1β及肿瘤坏死因子α（TNF-α），在一定程度上改善心脏肥大、纤维化和心肌功能障碍［12-13］。在缺血45 min后再灌注24 h的小鼠MIRI模型中发现，CARD9-/-小鼠比野生型（WT）对照小鼠梗死面积更小，心脏和血清中中性粒细胞浸润、磷酸化p38 MAPK及细胞因子TNF-α、IL-6、CXC趋化因子配体1（CXCL1）、单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）水平下降，提示敲除CARD9对心肌再灌注损伤起一定的保护作用［14］。此外，秦星［15］研究也发现，CARD9在MIRI的心肌组织中含量升高，且这种升高与中性粒细胞浸润呈正相关，敲除CARD9可通过阻断NOD2-MAPK通路介导的炎症反应减弱MIRI后心脏功能的损害程度，并且在MIRI环境中，CARD9可能还参与了其他模式识别受体介导的炎症反应。在另一项研究中，研究者使用小干扰RNA（siRNA）对急性胰腺炎大鼠进行了CARD9基因沉默，发现沉默CARD9的大鼠胰腺组织中NF-κB p65和p38 MAPK表达下降，并且中性粒细胞浸润和髓过氧化物酶活性显著减弱，提示沉默CARD9基因可以减少胰腺组织中的炎症反应［16］。由上可见，基于CARD9及p38 MAPK在炎症反应中的作用，抑制p38 MAPK依赖性过度活跃的炎症反应可能是MIRI的潜在治疗策略，靶向产生转导炎症反应的细胞因子及吸引浸润性免疫细胞进入心肌的趋化因子有可能成为未来对抗MIRI的新方向。

1.2 通过激活NLRP3炎症小体调控心肌细胞炎症反应 NLRP3炎症小体是一种与心血管疾病发生发展密切相关的炎症细胞死亡形式，NLRP3可以募集含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）的前体和含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白以形成NLRP3炎症小体，其介导的Caspase-1信号通路能够诱导细胞焦亡，在MIRI中可导致炎症介质的大量产生和心肌细胞死亡，进而引发心室重构［17］。目前，只有少数研究探索了CARD9信号介导的NLRP3炎症小体激活在MIRI中的作用机制，但通过其他研究结果或许可以间接了解两者的关系。CARD9在真菌感染中可上调IL-1β的产生，而在小鼠骨髓衍生巨噬细胞中却抑制脾酪氨酸激酶（Syk）磷酸化并抑制之后的NLRP3活化及Caspase-8向炎症小体的募集，负向调节NLRP3炎症小体诱导的IL-1β产生，以响应沙门菌感染［18］。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2（Ripk2）是一种在NLRP3炎症小体激活期间通过与Caspase-1竞争性结合来抑制NLRP3活性的分子，XU等［19］研究发现，在脂多糖诱导的败血症小鼠模型中，CARD9-/-小鼠表现出更严重的肠道炎症和肠道屏障功能障碍，CARD9可通过募集Ripk2来抑制NLRP3炎症小体的过度激活和随后IL-1β、IL-18的过度产生。因此，CARD9可视为NLRP3炎症小体激活的负调节因子，其在MIRI及其他心血管疾病中的作用有待进一步研究。

2 CARD9通过调控心肌细胞凋亡介导MIRI发生发展

心肌细胞凋亡可诱导心脏重构并导致多种心血管疾病以致心功能障碍［20］，多项研究表明，CARD9在此过程中发挥重要作用。线粒体依赖性细胞凋亡是MIRI后心肌细胞死亡的一种突出形式，其特征是诱导线粒体释放细胞色素C，细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）结合形成凋亡小体［21］。凋亡小体是一种多亚基蛋白复合物，可作为半胱天冬酶激活的平台。LI等［22］研究发现，CARD9在 H9c2心肌细胞中受过氧化氢的刺激而表达增加，而CARD9的缺失能够显著增强氧化应激反应；进一步对其机制进行研究，发现CARD9的CARD结构域有助于抑制线粒体依赖性细胞凋亡。同时，与WT小鼠比较，CARD9-/-小鼠在MIRI后表现出更高数量的凋亡细胞，CARD9可通过与Apaf-1结合使细胞色素C-Apaf-1-proCaspase-9凋亡复合体分离，从而减少心肌细胞凋亡。PETERSON等［23］研究也表明，CARD9在心肌细胞和内皮细胞中表达，主要通过抑制Caspase-9的激活来减少心肌细胞凋亡。这些发现提示心肌细胞上的CARD9在应激环境下表现出抗凋亡作用以保护心脏，这与其在炎症反应中的作用不同。YAN等［24］在心肌梗死后第3天观察到Dectin-2（一种在骨髓细胞上表达的模式识别受体）敲除小鼠的梗死愈合改善和心肌细胞凋亡率下降，而这一结果归因于激活了Syk-CARD9-NF-κB通路诱导的细胞因子产生。CARD9对心肌细胞影响的差异除了CARD9信号传导的不同通路之外，还可能因为所研究细胞类型的不同而产生，比如CARD9在心肌细胞上表现出抗凋亡作用［22］，而在骨髓细胞上可能表现出促凋亡作用［24］。也就是说，不同的细胞环境可能存在不同的细胞凋亡调节机制。鉴于CARD9介导的心血管疾病中有关心肌细胞凋亡的研究数量有限，在未来希望可以从关于CARD9上游靶标的研究中找到一些线索，以更好地解释这种差异。

3 CARD9通过调控心肌细胞自噬介导MIRI发生发展

自噬是一种自然的自我清洁过程，通过溶酶体降解受损的细胞器和多余的蛋白质来维持细胞在压力环境中的平衡［25］，对于细胞存活至关重要。在心血管疾病中，自噬是一把双刃剑。一方面，自噬是对限制心脏损伤压力条件的适应性反应；另一方面，在某些压力条件下，过度的自噬激活可能对心脏有害［26］。及时再灌注是治疗AMI的有效方法，能够最大限度减少血流恢复时间，对于治疗AMI和减少再灌注损伤至关重要。研究显示，MIRI后活性氧激活可诱导心肌细胞发生自噬［27］。LI等［28］研究发现，在缺氧/复氧或过氧化氢反应中，CARD9表达在MIRI小鼠心脏、H9c2心肌细胞及新生大鼠心室肌细胞中增加；且与WT小鼠相比，CARD9-/-小鼠在MIRI后表现出更明显的心功能障碍。该团队进一步研究显示，在体外和体内MIRI过程中，CARD9的缺失均可通过微管相关蛋白1轻链3（LC3）酯化和p62（一种已知会被自噬降解的蛋白质）积累减少抑制自噬。自噬的发生有3个关键步骤，即自噬体形成、自噬体与溶酶体融合成熟、自噬溶酶体形成。自噬体可以通过组成复合物来刺激形成，该复合物包含紫外线辐射抗性相关基因（UVRAG）、自噬相关基因beclin-1及磷脂酰肌醇3激酶催化亚基3（PI3KC3）。Rubicon是一种公认的自噬负调节因子，LI等［28］研究显示，CARD9可以与UVRAG竞争性结合Rubicon，导致UVRAG释放与beclin-1、PI3KC3组成复合物，最终促进自噬体的形成、成熟和内吞作用，提示心肌细胞中CARD9与Rubicon能够相互作用，以恢复自噬通量来保护心肌细胞免受MIRI诱导的细胞死亡和损伤。然而，PETERSON等［29］在主动脉弓缩窄诱导的压力过载致心功能障碍小鼠模型中发现，CARD9-/-减轻了小鼠心功能障碍，并且可以观察到自噬标志物微管相关蛋白1轻链3BⅡ（LC3BⅡ）/LC3BⅠ的比值增加，自噬受体蛋白p62表达降低，提示CARD9-/-恢复了功能失调的心肌自噬。这一结果与LI等［28］研究结论相反，这种不一致可能是由于使用了不同的模型，导致疾病环境有所差异造成的。PETERSON等［29］研究的是慢性疾病模型，而LI等［28］研究的是急性损伤模型。这也提示我们，CARD9通过上调自噬来保护心肌的作用可能只在急性心肌损伤中发挥作用，因此，未来需要更多研究来验证和确认这些结论。

综上所述，CARD9信号传导诱导的促炎作用已被证实参与MIRI的心脏损伤及重塑，因此，通过靶向干预CARD和CARD9介导的信号通路进行抗炎治疗可能是一个很有前景的选择。目前，体内干细胞注射治疗心肌梗死的方案已在研究中，ZHAO等［30］在注射干细胞的心肌梗死模型中发现CARD9-/-小鼠的早期死亡率降低，并且含有T细胞和巨噬细胞的肉芽肿形成较对照组小鼠明显减少，提示CARD9的免疫抑制作用可预防体内干细胞治疗中巨噬细胞介导的急性免疫损伤，进而保护MIRI后的心功能并可显著提高患者存活率。此外，有学者认为CARD9是锌离子介导信号转导的潜在靶标，WANG等［13］研究发现，锌补充剂可以通过抑制CARD9/BCL10信号传导来预防小鼠模型中与肥胖相关的心脏肥大，锌可以与CARD9的CARD结构域结合，抑制CARD9-CARD聚合成螺旋体，从而抑制CARD9/BCL10信号传导。最新研究显示，CARD9的化学抑制剂BRD5529可以显著降低肺孢子菌肺炎小鼠肺组织中IL-6和TNF-α的产生以减轻肺部炎症，研究者同时对BRD5529用于临床研究的安全性进行了验证，研究结果数据支持对该抑制剂进行更为广泛的体内测试，以期作为治疗宿主免疫反应的辅助治疗［31］。但是，迄今为止，关于CARD9与MIRI的相关研究仍然有限，尤其对CARD9在不同细胞类型（如骨髓细胞和心肌细胞）中的确切机制需要进一步探索。因此，针对CARD9的未来研究应关注其在MIRI中的主要上、下游分子以及与其他信号分子的串扰，同时对于CARD9的表观遗传修饰机制，如磷酸化和泛素化等进行更深入的研究。期待有更多关于CARD9的动物实验及临床研究出现，或可会为MIRI的治疗开辟新的方向。