宏基因组二代测序技术在免疫功能低下肺部感染患者诊断中的应用研究进展

考吾沙尔·巴合提江，夏宇，穆坎代斯·吐尔迪

新疆医科大学第一附属医院呼吸与呼吸危重中心二病区，乌鲁木齐 830011

宏基因组二代测序（mNGS）是一种可同时独立无偏移检测数千至上亿基因片段的检测技术，其可以同步迅速检测各类标本中的多种病原体，如细菌、病毒、真菌和寄生虫等，在感染性疾病诊断中的临床应用越来越多。免疫功能低下患者包括接受长期或大剂量类固醇或其他免疫抑制药物的患者、实体器官移植患者、过去5年需要化疗的实体瘤患者或自诊断和接受治疗以来的任何时间患有血液系统恶性肿瘤，以及患有原发性免疫缺陷的患者［1］。在免疫功能低下的肺部感染患者中，细菌性肺炎最多见，其次是病毒和侵袭性真菌感染，常规微生物检测方法（CMTs）存在周期长、准确性有限等缺点，尤其在处理多种病原体混合感染、危重症患者时，易出现诊断延迟或疏漏［2］。mNGS作为一种新的检测手段，拓宽了病原体检查的途径和范围，提高了检测效率，从而帮助患者改善预后。现就mNGS在免疫功能低下肺部感染患者诊断中的临床应用综述如下。

1 mNGS在恶性血液病肺部感染患者诊断中的应用

自体干细胞移植是某些血液系统恶性肿瘤的主要治疗方法之一，在移植之前要进行大剂量的化疗，因而会引发免疫功能低下，这也是该类患者发生较高治疗相关并发症及病死率的原因。肺部感染是自体干细胞移植中最常见的并发症，占所有并发症的60%［3］。在干细胞移植后，mNGS早期可起到鉴别肺部渗出病变是否为肺部感染的作用，晚期可迅速检测出感染的病原体，而且mNGS检测结果不受免疫抑制或粒细胞缺乏的影响［4］。

一项回顾性研究纳入了71例造血干细胞移植后发热患者，根据mNGS和CMTs结果确诊54例肺部感染，比较mNGS与CMTs对肺部感染的诊断价值发现，mNGS总体敏感度高于CMTs，但特异度低于CMTs，考虑其原因可能与标本类型及mNGS测序序列数设置有关［4］。在mNGS检测结果中，最多被识别到的病原体是病毒，其中巨细胞病毒（CMV）占比最高；其次是混合感染，以细菌—病毒混合感染最多。感染类型在移植的不同时期各不相同，但不论哪个时期，主要致病菌都是CMV， 血液中CMV DNA的荧光定量PCR是首选诊断方法， 但在免疫抑制状态的患者中，有50%无法在血液中检测到CMV DNA［5］，而血清抗体在这些免疫功能低下患者中可能是阴性或者不确定有没有产生相应抗体［6］。与CMTs比较，mNGS对CMV有更好的诊断效率，弥补了CMTs肺部CMV感染检出率低的不足。对于高度怀疑病毒性肺炎且CMTs持续结果阴性患者，mNGS技术能为其诊断提供进一步的线索。

有研究发现，mNGS在血液系统恶性肿瘤患者中有比CMTs更高的肺部感染检测敏感性（87.3%vs34.5%）［7］。mNGS检测结果显示，血液系统恶性肿瘤患者肺部感染最常见的细菌、病毒和真菌分别为肺炎链球菌、CMV和曲霉菌，最常见的混合感染类型是细菌—病毒、真菌—病毒。通过mNGS检测结果，该研究中90.9%的肺部感染患者及时进行了合适抗菌药物治疗，30 d病死率为7.3%，这提示mNGS技术对于提高血液系统恶性肿瘤患者抗菌药物治疗疗效以及降低病死率具有积极意义。

研究显示，肺部感染是血液病中性粒细胞减少伴发热患者死亡的独立危险因素［8］。ZHANG等［9］在抗生素治疗失败后伴有发热性中性粒细胞减少症的恶性血液病患者中检测出192例重症肺炎患者，使用mNGS技术联合CMTs进行病原体检测，发现mNGS和CMTs的病原体总检出率分别为80%和25%，其中细菌检出率分别为48%及9%、病毒检出率分别为42%及12%、真菌检出率分别为22%及4%。mNGS和CMTs检测出的常见细菌、病毒和真菌种类是一致的，分别是葡萄球菌、CMV及曲霉菌；二者在混合感染中的检测敏感度分别为80%和4%。该研究中，临床医生根据mNGS检测结果对45%的患者调整了抗生素治疗方案，并且有52%的患者症状得到有效缓解。

2 mNGS在实体器官移植肺部感染患者诊断中的应用

急性器官移植后排斥反应随着免疫抑制剂的应用显著下降，但实体器官移植患者机会性感染的发生率及病死率仍然较高，其中以肺部感染最为多见。孟现林等［10］报道了35例在ICU治疗的器官移植后感染肺炎患者，通过mNGS技术检测出20例病毒性感染，而CMTs仅检测出2例，提示mNGS在检测敏感度上有明显优势；mNGS对细菌的敏感度为93%，阴性预测值（NPV）为91%，其中铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌及肺炎克雷伯菌的检出率较高。该研究中mNGS联合CMTs后确诊混合感染患者为23例，仅通过mNGS技术诊断出21例患者为混合感染。对于真菌，mNGS没有体现出明显优势，比如，CMTs在检测白色念珠菌及热带念珠菌方面显示出一定优势，而mNGS对曲霉菌的检出率更高，这可能与mNGS技术核酸提取时破壁困难引起的低序列有关。因此，mNGS可以作为ICU住院的器官移植患者病毒及细菌感染的常规诊断方法，但在真菌鉴定中，mNGS和CMTs均有各自优势， 目前大部分学者也认为mNGS在检测细菌方面其性能优于CMTs，但在真菌检测方面逊于 CMTs［10］。

对于肺移植后早期感染患者，mNGS诊断肺部感染的检出率显著高于CMTs（97.14%vs68.57%），并且mNGS具有更高的NPV（83.33%），有助于排除感染，从而协助临床方案的选择。在51份肺泡灌洗液（BALF）标本中，mNGS鉴定出148种病原体，体现了其检测范围广泛的独特优势。其中，细菌有94种（68%），最常见的细菌是葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌；鉴定出的真菌和病毒在综合评估后被认为是定植菌。所以，临床医生需结合mNGS、CMTs、流行病学史和临床特征后综合判断致病病原体。在临床中，器官移植后早期很难区分感染与急性排斥反应。研究显示，器官移植早期mNGS检测阴性结果对肺部感染鉴别诊断有辅助作用。尤其对于嗜肺军团菌、脓肿分枝杆菌等非典型病原体，mNGS检测具有绝对优势。根据mNGS和CMTs结果可以对62%的患者调整抗生素治疗方案，从而使患者病情明显好转［11］。除了上述BALF的标本以外，血标本可以成为另一种替代选择，尤其是在病因不明的无法选择支气管镜检查的肺部感染中［12］。

3 mNGS在先天性免疫缺陷肺部感染患者诊断中的应用

先天性免疫缺陷（IEI）是由单基因突变引发的一种遗传性疾病，肺部感染是IEI患者反复住院和最终死亡的主要原因［13］。在一项前瞻性研究中发现，IEI患者急性感染住院率为85%，虽然在早期会预防性使用抗感染治疗，但仍有40%的患者病情无法得到控制，而且有药物相关毒性反应和抗病毒耐药性的风险发生［14］。因此，及时有效识别并进行抗感染治疗对于降低感染相关病死率具有重要意义。

CMV是常见的机会性病原体，几乎所有IEI患者都会感染CMV，CMV感染是IEI患者进行移植前后感染发病率及病死率的独立危险因素［15］。TANG等［14］研究了15例IEI疑似肺部感染患者，发现CMTs和mNGS检测结果一致率为73.3%，而细菌培养法与mNGS的一致性仅为33.3%，可能因为患者早期接受经验性抗菌药物治疗降低了细菌培养法的检出率。mNGS与临床诊断的阳性一致性显著高于CMT和培养法（分别为93.75%、68.75%和31.25%）。先天性免疫缺陷患者更易感染机会性病原体和非典型病原体，而这些病原体很难通过传统细菌培养法、PCR、血清抗体等CMTs鉴定出来。mNGS能够迅速、精准、全面的识别病原体，对抗生素治疗方案的选择及调整有很大帮助，也对排除感染和减少抗菌药物滥用具有重要价值。

4 mNGS在艾滋病肺部感染患者诊断中的应用

机会性感染是艾滋病患者的主要死因之一，在艾滋病患者中，肺部感染发生率为70%。XU等［16］使用mNGS检测了46例艾滋病患者疑似机会性感染的病原体，结合mNGS、CMTs和临床表现后确诊33例为机会性感染，通过mNGS技术检测出JC病毒和惠普莱毛蕨等特殊病原体，但CMTs未能鉴定出这些特殊病毒和非典型病原体。mNGS对真菌、非结核分枝杆菌和病毒的检测敏感度分别为90.91%、100%及100%，相应特异度也较高（分别为74.29%、86.67%及91.11%），而对于真菌检测敏感度较其他研究［17］明显增高，这可能是由于该研究的样本量较小造成的。mNGS及CMTs两种诊断方法对其他病原体（细菌、结核分枝杆菌、病毒等）检出率没有显著差异；混合感染患者的CD4+T淋巴细胞计数明显低于单一感染患者，提示CD4+T淋巴细胞减低患者更容易发生混合感染，所以mNGS可能对CD4+T淋巴细胞计数低的患者更有诊断价值。在鉴别非感染性病因中，mNGS检测结果能够起到提示性作用，如1例艾滋病患者淋巴结活检确诊为卡波氏肉瘤，mNGS在淋巴结组织中也检出疱疹病毒8型，对最终确诊有较好的提示意义［16］。

多项关于艾滋病患者中罕见病原体感染的病例报告，如利什曼原虫、巴尔通体、刚地弓形虫等，均是通过mNGS鉴定确诊的［17］。因此，在临床上对于多次CMTs结果阴性且多次经验性抗感染治疗无效患者推荐使用mNGS检测方法，对早期鉴定病原体后及时调整治疗方案，进一步改善临床预后及降低病死率有帮助。mNGS有望成为艾滋病患者一线诊断方法，但检测到的病原体可能不是真正的致病病原体，可能是污染或定植菌，因此最好的诊断策略是mNGS和CMTs结合综合评估。

综上所述，肺部感染是各类免疫功能低下患者发病率与病死率的较高重要原因之一，及时准确的病原学诊断对这些患者极其重要。mNGS在检测免疫抑制患者感染性病原体中具有巨大的诊断潜力，在未来可能成为补充常规诊断方法的宝贵工具，尤其在CMTs不能及时明确病原体种类时。