华支睾吸虫感染致肝损伤的机制研究进展

闻厚岚,刘丹霞

(湖北科技学院医学部基础医学院人体寄生虫学教研室,湖北 咸宁 437100)

华支睾吸虫病在我国分布广泛,宿主多通过食用含有华支睾吸虫囊蚴生的或半生的淡水鱼、虾而感染,早期会表现出过敏反应和消化道不适等症状,随着病程的发展,寄生的华支睾吸虫会导致患者的肝脏发生病变。世界卫生组织(WHO)的国际癌症研究机构(IARC)也早已把华支睾吸虫归类为I类生物致癌物[1]。本文将浅析华支睾吸虫感染人体后,通过活化肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)并最终导致肝损伤的机制。

1 HSCs细胞简介

HSC是常驻肝脏的非实质细胞群。在正常肝脏组织内,HSCs处于静止状态,胞浆内含有丰富的维生素A的脂滴。作为储存视黄醇衍生物的首要部位,在静止时HSCs不会表达α平滑肌肌动蛋白。因为其可塑性在肝纤维化中起到调节作用,当HSCs受到相应刺激后,HSCs会以自适应的方式,通过重编程中心碳代谢、增强增加线粒体活性及数量、启动内质网应激以及通过储存在细胞质液滴中的视黄脂的自噬依赖性和水解作用释放脂肪酸等途径,从静止状态转化为能分泌细胞外基质的增殖性、运动性的肌成纤维细胞。这些成纤维细胞会获得一系列使肝脏纤维化的特征,这些特征会共同使肝脏损伤和肝纤维化持续存在。以上由HSCs转分化为成纤维细胞,再由成纤维细胞分泌细胞外基质,长期累积导致肝脏纤维化,这个过程是肝脏外组织代谢调节的经典范例,并且在人体的肝脏损伤反应方面也是一个决定性的因素[2]。

2 华支睾吸虫分泌产物(CsESPs)活化HSCs的通路

2.1 TGF-β/Smad通路

TGF-β/Smad信号传导通路是作用于HSC活化的信号通路之一,是TGF-β信号进入细胞核的核心途径[3]。TGF-β/Smad信号传导通路由三大“家族”组成,包括TGF-β“超家族”、TGF-β“超家族”受体、Smad蛋白“家族”。而TGF-β是重要的促进肝脏纤维化的细胞因子,其中包含的TGF-β1被认为是造成肝脏纤维化最为关键的因子。TGF-β1在肝脏处于正常状态时表达极少,当肝损伤发生时,会有大量的TGF-β1分泌并导致HSC的活化,活化后的HSC也会分泌TGF-β1。在肝纤维化的过程中,TGF-β1会相继与自身磷酸化的TGF-βRⅡT和TGF-βRⅠ相结合,并将TGF-β1的信号传递至下游的信号分子Smad蛋白家族。与TGF-β1结合的TGF-βRⅠ会磷酸化Smad2/3,而Smad2/3又会与Smad4结合形成复合物并被转位至细胞核,从而调节特异性靶基因的转录,通过这个路径,肝纤维化由此产生。根据所查找到其他相关文献,验证了华支睾分泌排泄产物ESPs促进HSCs的激活,并最终导致肝纤维化是通过TGF-β/Smad信号传导通路传导。研究指出[4],通过使用TGF-β受体I抑制剂LY2157299干扰TGF-β/Smad途径,可抑制CsESPs诱导的HSC的激活,这表明TGF-β诱导的信号通路参与了CsESPs所引起的HSCs激活。

2.2 TLR通路

人体的先天免疫系统是保护宿主免受微生物病原体入侵的第一道防线,宿主细胞会表达各种模式识别受体(PRR),这些受体可以感知各种病原体相关的分子模式(PAMP),比如脂质、脂蛋白、蛋白质和核酸等。各种模式的识别受体对各种病原体相关分子模式的识别会激活细胞内信号通路,并最终诱导炎症细胞因子、趋化因子、干扰素(IFN)和共刺激分子的上调。根据相关文献[5]可知,在哺乳动物中,树突状细胞(DC)和巨噬细胞等在抗原呈递细胞上表达的TOLL样受体(TLR)“家族”是关键的模式识别受体,在诱导先天免疫反应以及之后的适应发展中起重要作用。而人体内的TOLL样受体(TLR)“家族”亦是会起到相同的诱导作用。相关的TOLL样受体属于I型膜蛋白,与负责识别PAMP的富含亮氨酸重复序列(LRR)以及IL-1受体细胞区域同源的胞质结构域(TIR结构域)组成胞外域,这是下行信号通路指令所必需的。目前已经有11个人类TOLL受体和13个小鼠TOLL受体被鉴定[5],每个TOLL受体都能识别来自各种微生物的不同的分子模式,比如:TOLL受体4及其细胞外成分,可识别革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS),从而导致感染性休克。还有研究显示[4],TLR4信号传导通路也是华支吸虫的分泌排泄物CsESPs激活HSC的信号传导路径之一。在该文献的实验研究中,对比发现,具有华支睾吸虫分泌排泄物CsESPs的HSCs中,TOLL受体4的表达在24h内显著增加。

2.3 JNK通路

作为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员C-jun-N-末端激酶(JNK),会介导真核细胞对各种非生物以及生物的应激损伤反应,以及通过基因表达,细胞骨架蛋白动力学和细胞死亡或存活的影响来调控重要的生理过程,这些反应包括免疫学作用,神经元功能和胚胎发育等。因JNK底物的功能多样性,JNK信号传导十分普遍,控制也十分多样。MAPK家族的JNK是通过中继、放大和整合这三步来传递各种细胞内和细胞外的刺激信号。大多数CMGC激酶和所有的MAPK都需要通过对活化环进行磷酸化才能获得完全的催化活性,其中JNKs是激化循环的必需成分,它可以通过正向或者负向的调控直接控制较低层激酶(MAPKs)的活动。更为广泛的说,JNK通路属于“第三层”的MAPK通路,作为典型的信号转导级联通路组成部分,在这些途径中,首先由顶层激酶(MAP3Ks)接受各种信号的输入,中间层激酶(MAP2Ks)则会严格依赖上层激酶进行激活,而较低层激酶(MAPKs)最终会磷酸化从而引发大量的监管反应底物生成,比如引发生成作为监管底物之一的JNKs。JNK通路则会因响应广泛的刺激而被激活,但最为显著的是在细胞暴露于各种生物或非生物的应激之后,例如感染、炎症、氧化应激、DNA损伤、渗透应激或细胞骨架的变化这些来自细胞外的刺激因素刺激后而被激活。由于JNK信号传导通路是许多动物先天免疫通路的关键组成部分,许多细菌、病毒和真核寄生虫会直接“篡改”JNK通路,以逃避、抑制或修改免疫反应以发挥优势,利于其生存[6]。

分泌型磷脂酶A2(sPLA2)作为华支睾吸虫分泌的蛋白质中的一种,也是排泄CsESPs的组成部分,其因肝纤维化和抑制肿瘤细胞生成的作用而广为人知。根据有关研究文献可知[7],通过腹腔注射50yg/mL MBP-CsPLA2到BALB/c小鼠体内,并对小鼠的肝脏切片进行HE和Masson染色,观察肝切片以检测胶原蛋白的积累,同时对小鼠的肝脏中相关蛋白进行Western blot检测,以检验JNK信号通路是否被激活。其肝脏切片可以显示出明显的胶原累积,并通过肝组织的蛋白印迹可以看到清晰的P-JNK1条带。该实验证明,sPLA2可经由JNK通路活化HSC,并由HSC转分化为成纤维细胞,经过成纤维细胞分泌细胞外基质,导致胶原蛋白的累积最终导致小鼠肝脏的损伤。

3 华支睾吸虫感染致肝损伤的相关蛋白

3.1 华支睾吸虫溶血磷脂酶(CslysoPLA)

CslysoPLA作为磷脂酶家族的成员分布广泛。这种酶可使溶血磷脂酶脱酰基,可能在寄生虫和真菌的毒力和发病机制中起关键作用[8]。研究人员在实验中表达并表征了CsLysoPLA,并观察到CslysoPLA上调了HSC系(LX-2)中促进纤维化基因的表达;该项实验在体外检测时使用了CsLysoPLA处理过的巨噬细胞系(RAW264.7),以期检测该细胞系中IL-25水平,随后在对IL-25水平的检测中发现,感染华支睾吸虫的小鼠血清中IL-25含量显著升高,并且这种趋势与感染期间肝纤维化的程度呈正相关。基于这个结果,上述实验中相关研究人员推测CsLysoPLA会在成虫体内经CsESPs的诱导后,渗入患者下级胆管附近破裂的毛细血管中,然后通过蛋白激酶A(PKA)上调人体巨噬细胞中IL-25含量,从而激活HSC,通过ERK1/2通路,促进患者肝脏的纤维化。由上可知,CslysoPLA可能经由ERK1/2通路,通过蛋白激酶A(PKA)依赖的B-Raf原癌基因(BRAF)上调巨噬细胞中的IL-25从而激活HSC转分化为成纤维细胞,并分泌细胞外基质,促进肝脏纤维化,最终导致肝脏损伤。

3.2 华支睾吸虫铁蛋白重链(CsFHC)

CsFHC属于亚铁氧化物酶,负责原核生物和真核生物中的铁储存。铁蛋白分子由两种结构不同的亚基类型组成,分别为H链和L链。H-铁蛋白已经被证明可以调节免疫功能[9],包括调节造血、肝细胞的凋亡和细胞分化等过程,且CsFHC也在各种疾病中均表现出肝外免疫的调节特性。CsFHC在华支睾吸虫的整个生命阶段都会有表达。用CsFHC处理人HSC系LX-2会通过NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶和诱导型一氧化氮合酶的时间依赖性激活触发自由基。自由基的增加大大促进了细胞溶质IkBα的降解和NF-κB亚基(p65和p50)的核转位。由上可知,CsFHC会通过NF-κB信号传导,触发相关自由基的活化,从而引起肝脏有关的慢性炎症,进而导致肝脏的损伤。

3.3 氧化还原活性蛋白NF-κB和过氧化物酶6(Prdx6)

作为华支睾吸虫感染期间由ESP诱导的氧化还原活性蛋白NF-κB和Prdx6,两者会相互调节。有研究发现[10],当Prdx6过表达时,相关细胞会通过抑制由ESP处理的胆管癌细胞中的NADPH氧化酶2和诱导型一氧化氮合酶的活化来抑制细胞内自由基,从而显著减轻NF-κB介导的炎症。当NF-κB过表达时,会与启动子内两个κB位点结合来降低Prdx6的转录水平。在受感染的小鼠肝脏中免疫反应染色强度和程度与病变严重程度和感染持续时间成正比。由上可知宿主在感染华支睾吸虫期间,NF-κB和Prdx6的组成升高可能与由华支睾吸虫介导的持续性肝胆异常有关。从上推知,当氧化还原活性蛋白NF-κB和Prdx6组合出现,两者均没有过表达时,随着病情的进展,可能会对肝脏造成持续性影响。

3.4 华支睾吸虫膜联蛋白A7(CsANXA7)

作为华支睾吸虫基因库膜联蛋白之一的CsANXA7,虽然不会直接导致肝脏的损伤,但是会通过调整宿主的免疫应答、炎症反应等使得华支睾吸虫可以长期寄生在宿主体内,从而对宿主的肝脏造成损伤。相关文献表明[11],CsANXA7能较好的降低由细菌脂多糖LPS活化的巨噬RAW264.7所产生氧中介物ROS和NO水平,并且能抑制巨噬细胞RAW264.7细胞的增殖。氧中介物ROS和NO的水平降低,巨噬细胞增殖的减少,都是有利于华支睾吸虫在宿主体内更好的生存下去。CsANXA7通过上述机制对其宿主的免疫反应等过程进行调节,从而使华支睾吸虫能较好的在宿主体内进行寄生,促进华支睾吸虫对宿主肝脏的损伤。

3.5 华支睾吸虫颗粒蛋白(CsGRN)

在CsGRN的实验研究[5]中,通过在正常肝细胞(LO2-GRN细胞)中构建具有能稳定表达CsGRN的细胞系,并通过定量RT-PCR和蛋白质印记等相关技术,评估了LO2-GRN细胞中RAS/MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路激活的标志物水平。发现CsGRN通过调节表皮生长因子受体(EGFR),从而调高了p-EGFR、RAS、p-ERK、p-AKT、p-PI3K和p-BRAF的mRNA和相关蛋白质的表达水平。此外,过度表达的CsGERN通过诱导上皮间质转化(EMT)标记蛋白的上调,也能调节肝细胞向恶性方向发展。

华支睾吸虫分泌CsGRN,其通过调节EGFR介导的RAS/MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路,从而调高相关物质的分泌,进而促进肝细胞的恶性转化,导致肝脏损伤。此外,当CsGRN发生过度表达时,CsGRN会通过诱导上皮间质转化(EMT)标记蛋白的上调,调节肝细胞向恶性方向发展。

4 华支睾吸虫感染致肝损伤的相关细胞因子

4.1 白介素6(IL-6)

IL-6是人体内的重要炎性细胞因子,对急性和慢性肝炎反应过程均可进行调节。有文献[12]显示血浆中IL-6的水平与周围导管纤维化的风险程度成正比。在急性期时,充当刺激因子的IL-6能促进急性期的反应,造成病理反应的损伤。尤其是当患有华支睾吸虫病的患者病情严重时,IL-6作用的主要靶细胞便是肝细胞。人体的肝脏作为重要的代谢器官,在正常代谢时,会通过血液循环逐渐清除血液中的IL-6。而华支睾吸虫病患者血清中IL-6持续升高,不仅反映了患者肝脏受损程度的加重,同时也反应出华支睾吸虫的感染对患者的肝细胞和肝脏组织的损伤是持续性的。随着病情加深,血液中的IL-6不断作用于肝细胞,最终会导致肝脏纤维化等损伤的发生。

4.2 环氧化酶(COX)

COX有3种异构体,分别为COX-1、COX-2和COX-3。COX-1主要是参与维持细胞的结构和稳态。COX-2是一种功能强大的酶,可以启动炎症并促进前列腺素的合成[13]。在受到脂多糖(LPS)或其他促炎症反应的刺激后,COX-2被保留在Kupffer、星状细胞、小鼠肝细胞中。而LPS诱导的炎症反应的激活会通过TLR4/MyD88/MAPKs/NF-κB途径调节COX-2的表达,使COX-2的含量升高。而TLR4/NF-κB/MAPKs途径被视为是炎症反应的主要途径之一,因此,对于由LPS诱导的炎症反应会通过上述的相关途径而使COX-2高表达从而促进炎症的发生,最终导致肝脏的病变。

4.3 白介素13(IL-13)

作为Th2免疫反应中一种多功能的细胞因子IL-13,已经被广泛证实是促进纤维化的介质。基于LX-2肝星形细胞所做的一些实验[14],我们了解到,通过ELISA、RT-PCR和Western blotting分别评估IL-13、PGE2和PGI2处理的人类肝细胞中TGF-β1和PDGF的表达。同时,用电桥法和CCK8法检测细胞的增殖和活性,用PKC活性法检测PKC的活性,用PKC激动剂和拮抗剂来验证结果。发现IL-13、PGE2和PGI2明显增强了人造血干细胞中TGF-β1和PDGF的表达,这也明显改善了造血干细胞的增殖和细胞活性。此外,在IL-13、PGE2和PGI2处理后,PKC活性明显增加。在之前笔者陈述的关于TGF-β信号通路中,已经写到TGF-β1是造成肝脏纤维化最为关键的影响因子,当肝损伤发生时,会有大量的TGF-β1分泌并会导致HSC的活化。由此可知,在华支睾吸虫的感染过程中,IL-13是有助于肝纤维化进程发展的一个重要的炎性因子。

5 小 结

华支睾吸虫感染后,自身会分泌CslysoPLA、CsFHC、CsANXA7以及间接由ESP诱导合成的氧化还原活性蛋白NF-κB和Prdx6,均会直接或间接的参与到对肝脏损伤过程,而TGF-β/Smad、TLR以及JNK通路则是由华支睾吸虫本身分泌的相关代谢产物激活,并促进HSC的活化,由活化的HSC产生并累积细胞外基质,从而导致肝纤维化的发生。而炎性因子IL-6、环氧化酶COX-2、IL-13也是造成肝脏损伤的重要因素,可作为肝纤维化治疗的新靶点,值得在后续的研究中受到更多的关注。