体外和体内评价法分析苦杏仁油抗氧化能力

韩金承，孟 鑫，吴慎威，闫伊狄，陈瑞琦

（锦州医科大学食品与健康学院，辽宁 锦州 121000）

氧化应激反应是指生物体氧化与抗氧化能力失衡的一种状态[1]。当生物体内抗氧化系统无法与过量自由基结合时，过量的自由基会从邻近的分子（如蛋白质、脂肪酸、核酸等）上夺取电子，使机体组织产生不可逆的损伤，从而引起一系列如衰老、动脉粥样硬化、肿瘤等问题[2-3]。因此食用天然抗氧化成分是对抗氧化应激反应的有效手段之一。

苦杏仁油是从蔷薇科植物杏的成熟干燥种子中经提取得到的一种营养价值极高的植物油脂，其脂肪酸组成中约60%为油酸（顺式-9-十八烯酸）[4]。科学家们研究发现，油酸具有极佳的抗氧化、延缓衰老和清除自由基的能力[5-6]。因此研究苦杏仁油在抗氧化方面的作用具有一定的实际应用价值。

目前常用的抗氧化能力测试方法有体外测试法和体内测试法。体外测试法主要是测定物质对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、超氧阴离子自由基（）、羟自由基（·OH）等自由基的清除能力[7]；体内测试法主要是通过建立动物模型，测定血清或部分器官中抗氧化酶类的活性和氧化代谢产物的含量来判断物质的抗氧化能力[8]。体外试验具有反应迅速、试验周期短等优点，但难以反映出体内真实的抗氧化水平；体内试验可以较准确地反映机体真实的抗氧化能力。本研究先通过体外试验测试苦杏仁油对自由基的清除能力和总还原能力，再通过体内试验测试苦杏仁油对小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量的影响，综合判断苦杏仁油的抗氧化能力。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

苦杏仁：购于锦州中药材市场；碱性蛋白酶：酶活性2×105U/g，购自南宁庞博生物工程有限公司；雄性昆明小鼠40 只（SPF 级、4 周龄），体重（20±3）g，由锦州医科大学动物实验中心提供（生产许可证号：SCXK（辽）2019—0003；实验许可证号：SYXK（辽）2019-0007）；饲养条件：空调房间，温度20～25 ℃，相对湿度50%～60%，分笼饲养，自由饮水、进食，每天更换垫料。

无水乙醇、无水甲醇、氢氧化钠、盐酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、Tris-HCl 缓冲溶液、邻苯三酚、磷酸盐缓冲液、硫酸亚铁、过氧化氢、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；SPF 大小鼠生长繁殖饲料（许可证号：SCXK（京）2019—0003）、实验动物玉米芯垫料：北京科澳协力饲料有限公司；总超氧化物歧化酶测定试剂盒（批号：A001-3-1）、丙二醛测定试剂盒（批号：A003-1-2）：南京建成生物工程研究所。

1.1.2 仪器与设备

DK-98-1 型恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；Sorvall Legend Micro21R 型离心机，赛默飞世尔科技公司；PHS-3C 型pH 计，上海仪电科学仪器股份有限公司；UV-5100B 型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；DHG-9140 型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司；MYP11-2A 型磁力搅拌器，上海酶颖浦仪器仪表制造有限公司；SuPerMax型光栅酶标仪，上海闪谱生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 苦杏仁的预处理

将苦杏仁投入沸水中保温10 min 后取出脱皮，按照料液比1∶12（g/mL）的比例加入蒸馏水，超声处理60 min（55 ℃、300 W），取出后于100 ℃鼓风干燥箱中干燥至恒重[9-10]。

1.2.2 苦杏仁油的提取

将预处理过的苦杏仁粉碎后，用40 目网筛筛选，按照料液比1∶8（g/mL）的比例加入体积分数为20.5%的乙醇溶液混匀，调溶液pH 为9.5，向溶液中加入3.5%的碱性蛋白酶并混匀，于45 ℃、750 r/min 的条件下磁力搅拌酶解147 min，结束后将溶液置于90 ℃水浴锅中水浴灭酶并挥发乙醇10 min，灭酶后的溶液于4 000 r/min 的条件下离心15 min，吸出油层。

1.2.3 苦杏仁油体外抗氧化试验

1.2.3.1 苦杏仁油对DPPH 自由基的清除作用

用无水乙醇将苦杏仁油稀释成浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL 的样液待用，用蒸馏水将VC 稀释成相同浓度并避光保存。空白管中加入2 mL 80% 甲醇溶液、3 mL 浓度为0.5 mmol/L 的DPPH甲醇溶液；测定管中加入2 mL 样品液、3 mL 浓度为0.5 mmol/L 的DPPH 甲醇溶液；对照管中加入2 mL样品液、3 mL 80%甲醇溶液，混匀后，在室温条件下避光静置30 min，于517 nm 处测定吸光值，无水乙醇调零[11]。DPPH 自由基清除率计算公式为：

式中：A测为测定管在波长517 nm 处的吸光度值；A对为对照管在波长517 nm 处的吸光度值；A空为空白管在波长517 nm 处的吸光度值。

式中：A测为测定管在波长325 nm 处的吸光度值；A对为对照管在波长325 nm 处的吸光度值；A空为空白管在波长325 nm 处的吸光度值。

1.2.3.3 苦杏仁油对·OH 的清除作用

采用Fenton 反应测定苦杏仁油对·OH 的清除能力，以VC 为对照进行试验。试验溶液配制：用无水乙醇将苦杏仁油稀释成浓度为0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mg/mL 的样液待用，用蒸馏水将VC 稀释成相同浓度并避光保存。管中加入2.0 mL 浓度为0.2 mol/L的磷酸盐缓冲溶液，1.5 mL 邻二氮菲，空白管中加入1.0 mL 浓度为7.5 mmol/L 的硫酸亚铁、5.5 mL 蒸馏水，对照管中加入1.0 mL 浓度为7.5 mmol/L 的硫酸亚铁、4.5 mL 蒸馏水、1.0 mL 0.1% H2O2溶液，测定管中加入2.0 mL 浓度为7.5 mmol/L 的硫酸亚铁、1.0 mL 样品液、2.5 mL 蒸馏水、1.0 mL 0.1% H2O2溶液，将以上各管混匀，将各管置于37 ℃条件下保温20 min，于510 nm 处测定吸光度，蒸馏水调零[13]。·OH清除率计算公式为：

式中：A测为测定管在波长510 nm 处的吸光度值；A对为对照管在波长510 nm 处的吸光度值；A空为空白管在波长510 nm 处的吸光度值。

1.2.3.4 苦杏仁油还原力的测定

将苦杏仁油用无水乙醇稀释成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的样液待用，用蒸馏水将VC 稀释成相同浓度并避光保存。在离心管中加入1.0 mL 样液和1.0 mL 浓度为0.2 mol/L 的磷酸盐缓冲液（pH 6.6）混合，混匀后加入1.0 mL 1%的铁氰化钾溶液，混匀后于50 ℃水浴20 min 后冷却，再加入1.0 mL 10%的三氯乙酸溶液，0.2 mL 0.1%的氯化铁溶液和0.8 mL 蒸馏水混匀，静置10 min 后，于3 000 r/min 离心10 min，取上清液于700 nm 处测定吸光度，蒸馏水调零[14]。

1.2.4 体内抗氧化试验

1.2.4.1 小鼠饲喂与建模

参照国食药监保化[2012]107 号文件中反应较迅速的乙醇氧化损伤造模法进行建模[15]。将40 只动物适应性喂养1 周后，随机分为5 组，每组8 只，依次设定为A（空白组）、B（对照组）、C（低剂量模型组）、D（中剂量模型组）、E（高剂量模型组）。分组后的小鼠先用基础饲料饲喂4 周，再进行灌胃处理4 周，空白组按照体重每只灌注0.05 mL/g 生理盐水，对照组按照体重每只灌注0.05 mL/g VE，低剂量模型组按照体重每只灌注0.05 mL/g 苦杏仁油，中剂量模型组按照体重每只灌注0.15 mL/g 苦杏仁油，高剂量模型组按照体重每只灌注0.25 mL/g 苦杏仁油[16]。末次灌胃后禁食16 h（期间正常饮水），然后按照12 mL/kg mb的灌胃量一次性给予每只小鼠50%乙醇。6 h 后采用摘除眼球采血法取血，分别搜集血液于EP 管中，后采用颈椎脱臼法处死小鼠。

1.2.4.2 SOD、MDA 指标测定

将装有血液的离心管于4 ℃条件下离心10 min（4 000 r/min），轻轻吸取上层血清后，使用对应的试剂盒进行严格的指标测定。

1.2.4.3 肝脏组织病理学观察

解剖小鼠并取出肝脏后对小鼠肝脏进行HE 染色，并于显微镜下观察组织形态[17]。

1.2.5 数据处理

数据统计类试验均重复3 次，采用SPSS 18.0 软件分析数据，采用Origin Pro9 软件统计数据并作图。

2 结果与分析

2.1 苦杏仁油体外抗氧化试验

DPPH·是一种稳定的以氮为中心的脂溶性自由基，其氮端有一个孤对电子，醇溶液呈紫色，加入抗氧化剂后，其孤对电子可以与氢配对，使紫色褪去，抗氧化剂能力越强，颜色褪去越明显。是一个氧分子获得一个电子而形成的，广泛存在于细胞的线粒体中，可进一步反应生成对细胞破坏力更强的过氧化氢和羟自由基；在碱性环境中，邻苯三酚可产生超氧阴离子自由基和带有颜色的中间产物，在反应体系中加入抗氧化剂可清除已产生的超氧阴离子并可以减缓邻苯三酚的氧化，因此可以通过测定吸光度来判断抗氧化剂的抗氧化能力。·OH 是机体氧化代谢过程中产生的氧化性最强的一种自由基，它可以破坏人体DNA 结构，使其出现永久损伤，还会破坏细胞膜结构，从而诱发衰老和其他多种氧化代谢疾病；Fenton反应生成·OH 促使Fe2+氧化为Fe3+，加入抗氧化剂会减缓这一反应，通过测定吸光度可以判断出其抗氧化能力。还原力与抗氧化能力成正比，常用铁氰化钾还原法来测定某一物质的还原力，抗氧化剂提供电子给Fe3+，使得Fe3+还原成Fe2+，通过吸光度的大小判断Fe2+的浓度，从而反映其抗氧化能力，吸光度越大，样品的还原能力越强[18-20]。苦杏仁油对DPPH 自由基、、·OH 的清除能力及对Fe3+的还原力见图1。

图1 苦杏仁油体外抗氧化能力Fig. 1 Antioxidant capacities of bitter almond oil in vitro

根据测试结果可以看出：苦杏仁油对DPPH·的清除能力呈梯度增加，但较同浓度的VC 差，半数清除率（IC50）为0.215 mg/mL；苦杏仁油对清除能力呈梯度增加，但较同浓度的VC 差，半数清除率（IC50）为0.378 mg/mL；苦杏仁油对·OH 的清除能力呈梯度增加，但较同浓度VC 差，半数清除率（IC50）为0.679 mg/mL；苦杏仁油对Fe3+的还原能力随剂量的增加而增强，但抗氧化能力弱于VC。出现以上情况可能是因为苦杏仁油中供氢体相对较少,且VC 作为水溶性抗氧化剂，反应时间更短，因此苦杏仁油的抗氧化能力相比同浓度的VC 差。

2.2 苦杏仁油体内抗氧化试验

2.2.1 苦杏仁油对小鼠体重的影响

试验期间各组小鼠体态生长良好，活泼好动，精神饱满，皮毛顺滑有光泽，饮食饮水正常，刚灌胃后出现短暂不适感，但片刻后即恢复正常。试验期间小鼠平均体重测定结果见图2。

图2 试验期间小鼠体重测定结果（n=8）Fig. 2 Body weights of mice during the experiment(n=8)

2.2.2 苦杏仁油对小鼠血清中SOD 活性和MDA 含量的影响

SOD 是生物体内源性抗氧化酶系统组成之一，可以清除机体产生的超氧阴离子和过氧化物等，减少生物体内活性氧的产生和蓄积，从而发挥清除自由基、保护细胞完整性等抗氧化的功效，生物体内SOD活性越高说明机体清除自由基、抗氧化能力越强。MDA 是体内细胞膜上不饱和脂肪酸与活性氧簇氧化代谢产生的脂质过氧化物，其含量可以反映细胞的氧化损伤程度，含量越低说明细胞被氧化损伤的程度越低[21]。各组动物血清中SOD 活性和MDA 含量的测定结果见图3。

图3 苦杏仁油对小鼠血清中SOD 活性和MDA 含量的影响（n=8）Fig. 3 Effects of bitter almond oil on SOD activity and MDA content in mice sera(n=8)

由图3 可以看出：低剂量模型组SOD 活性与空白组之间存在显著差异（P＜0.05），其余各组与空白组之间则存在极显著差异（P＜0.01）；各组MDA 含量与空白组之间均存在极显著差异（P＜0.01）；各组SOD 活性均高于空白组，MDA 含量均低于空白组，表明苦杏仁油对氧化损伤具有一定的保护作用。中剂量模型组小鼠血清SOD 活性值最高且MDA 含量最低，说明该剂量对氧化损伤的保护作用最强。

低、中、高剂量模型组中SOD 活性及MDA 含量均与对照组之间存在极显著差异（P＜0.01），中剂量模型组小鼠抗氧化能力与对照组最接近，其次为高剂量模型组，最后为低剂量模型组。

尽管苦杏仁油对生物体具有一定的抗氧化效果，但随着苦杏仁油摄入量增大，却表现出了抗氧化能力降低的情况，造成这种情况的原因可能是由于摄入过多苦杏仁油，延长了机体吸收利用的时间，反而导致油脂产生了促氧化效果，从而使得抗氧化能力有所下降[22]。因此苦杏仁油摄入量并不是越多越好，摄入量过多也许会产生负面效应。

2.2.3 苦杏仁油对小鼠肝脏组织病理形态学的影响

对各组小鼠肝脏切片进行HE 染色观察，结果见图4。肝脏是生物体内最重要的代谢器官，短时间内摄入大量乙醇会激发生物体氧分子发生氧化应激反应，产生自由基，从而引起组织细胞过氧化效应，造成肝细胞结构损伤和功能损伤，因此通过观察小鼠肝脏细胞的形态可以初步判断出其氧化损伤的情况。通过显微镜观察发现，空白组小鼠肝细胞之间连接松散、排列分散、界限模糊，对照组、中剂量模型组小鼠肝脏组织均匀、肝细胞形态完整，无明显脂肪浸润现象，无明显病理反应；低剂量模型组和高剂量模型组的小鼠肝脏出现不同程度的肝细胞形态不完整、脂肪浸润的现象，其中高剂量模型组的小鼠此种情况更为严重。这可能是因为低剂量模型组的小鼠体内拮抗氧自由基的供氢体含量较少，肝脏无法代谢短时间内摄入的大量乙醇，导致过多的乙醇对肝细胞造成破坏；高剂量模型组的小鼠由于长期摄入过多脂肪，能量过剩，富裕的脂肪转换为糖原储存在肝脏中导致肝细胞增大，同时肝细胞无法快速代谢短时间摄入的乙醇，从而造成了肝细胞形态破损和脂肪浸润现象[23]。

图4 小鼠肝脏切片HE 染色结果（200×）Fig. 4 HE staining results of mice livers slices（200×）

3 结论