血清miR-92a、miR-17、miR-19b 对冠心病患者冠状动脉病变程度的评估价值

王双双，张斌强，钱航，徐先琳，陈孝强，唐俊，翟宇新，陈继舜

湖北医药学院附属国药东风总医院心内科，湖北 十堰 442008

我国心脑血管疾病的发病率仍处于上升趋势，病死率居总死亡原因之首，其中冠心病（CAD）患者1 139 万［1］。CAD 主 要病 理 基础 为动脉 粥样 硬化（AS），其作为一种慢性动脉病变，可由氧化应激、炎症反应、脂质代谢异常、内皮细胞功能障碍等因素引起［2］。心源性猝死最常见的病因亦为CAD［3］，因此对CAD 早期诊断及干预至关重要。微小RNA（miRNA）作为一类高度保守的内源性非编码RNA，具有复杂的生物学功能，其可通过调控多种机制参与AS的发生发展［4］。miRNA 在病理状态下水平变化常早于其他循环生物标志物，故可作为心脑血管疾病早期诊断的新型生物标志物［5-6］。miR-92a、miR-17、miR-19b 作为miRNA 的重要分型，已有研究通过建立动物模型发现三者参与了AS 的发生发展［7-8］。然而，上述miRNA 在冠状动脉（冠脉）疾病中的作用临床性研究相对较少。因此本研究拟通过检测CAD患者血清中miR-92a、miR-17、miR-19b 表达，探讨三者与冠脉病变程度的关系，旨在为临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020 年1 月—2021 年7 月因胸闷胸痛不适就诊于本院心内科的92例患者，均行冠脉造影检查，依据造影检查结果分为对照组30例（未见冠脉狭窄或狭窄均＜50%）和CAD 组62 例（冠脉主要血管中至少有1 支狭窄程度≥50%）。排除先天性心脏病、心肌病、急性心衰、严重肝肾功能、血液风湿性疾病及恶性肿瘤等。两组均签署知情同意书，本研究已通过医院医学伦理委员会批准。

1.2 资料收集 收集各组以下资料：性别、年龄、收缩压、舒张压及血生化指标（TG、LDL-C、HDL-C、血尿酸、总胆红素等）。

1.3 血清miR-92a、miR-17、miR-19b 表达检测 均于入院24 h 内抽取空腹静脉血3～5 mL，3 000 r/min离心5 min（离心半径10 cm），分离血清，于-80 ℃冰箱保存。用天根RNA 提取试剂盒分离miRNA，用加尾法对提取的miRNA 行逆转录，得到其对应的cDNA 第一链。后采用实时荧光定量PCR 法对miR-92a、miR-17、miR-19b 进 行 扩 增，以 外 参（CR100）为参照。反向引物由天根试剂盒提供。引物：miR-92a 序列为UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU、miR-17 序 列 为CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG、miR-19b 序 列 为 UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA。反应体系：2×miRcute Plus miRNA PreMix 10 μL、Forward Primer和miRNA第一链cDNA各2 μL、Reverse Primer 0.4 μL，最后加入DEPC-H2O至反应溶液20 μL。反应条件：95 ℃ 预加热15 min；94 ℃变性20 s、75 ℃延伸30 s，共40 个循环。以2-ΔΔCT法计算miRNA相对表达量

1.4 冠脉病变程度判定 采用Gensini 评分［9］评估CAD 组冠脉病变情况。冠脉狭窄程度≤25%计1分、管腔狭窄＞25%～50%计2 分、管腔狭窄＞50%～75%计4 分、管腔狭窄＞75%～90%计8 分、管腔狭窄＞90%～99%计16分、管腔狭窄＞99%计32分；冠脉不同分支病变系数：左主干为5.0，左前降支近段、中段、远段为2.5、1.5、1.0，左回旋支近段为2.5，左回旋支中段、远段及右冠动脉为1.0，小分支为0.5。节段积分为血管狭窄评分乘以病变系数，最终评分即为各节段积分之和。依据Gensini 评分［10］将CAD 患者分为低评分组（≤40分）32例、高评分组（＞40分）30例。

1.5 统计学方法 采用SPSS23.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组比较采用t检验；非正态分布计量资料以M（P25，P75）表示，两组间比较采用非参数检验。计数资料比较采用χ2检验。用多因素Logistic 回归分析CAD 发生的影响因素；Spearman 相关分析法分析血清miRNA 表达与Gensini 积分的相关性；绘制受试者工作特征（ROC）曲线评价血清miRNA对CAD病情的预测价值，曲线下面积比较采用Z检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组、C AD组临床资料比较 CAD组HDL-C低于对照组（P＜0.05），两组其他临床资料比较差异无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 对照组、CAD组临床资料比较

2.2 对照组、CAD 组血清miR-92a、miR-17、miR-19b表达比较 CAD 组血清miR-92a、miR-17相对表达量高于对照组，血清miR-19b 相对表达量低于对照组（P均＜0.05）。见表2。

表2 对照组、CAD组血清miR-92a、miR-17、miR-19b表达比较［M（P25，P75）］

2.3 CAD发生的影响因素 将CAD作为因变量，以HDL-C、miR-92a、miR-17、miR-19b为自变量纳入多因素Logistic回归分析，结果显示miR-92a、miR-17表达升高为CAD发生的危险因素（P均＜0.05），而miR-19b表达升高为CAD发生的保护因素（P均＜0.05）。见表3。

表3 CAD发生影响因素的Logistic回归分析

2.4 低评分组、高评分组血清miRNA 相对表达量的比较 低评分组Gensini 积分为（20.98 ± 1.68）分、高评分组Gensini 积分为（73.10 ± 3.98）分。高评分组血清miR-92a、miR-17 相对表达量高于低评分组，血清miR-19b 相对表达量低于低评分组（P＜0.05）。见表4。Spearman 相关分析结果显示，CAD患者血清miR-92a、miR-17 相对表达量与Gensini 积分呈正相关（rs分别为0.529、0.519，P均＜0.05），血清miR-19b 相对表达量与Gensini 积分呈负相关（rs=-0.579，P＜0.05）。

表4 低评分组、高评分组血清miR-92a、miR-17、miR-19b表达比较［M（P25，P75）］

2.5 血清miR-92a、miR-17、miR-19b表达对CAD 患者冠脉病变程度的评估价值 ROC 分析曲线显示，血 清miR-92a、miR-17、miR-19b 及 三 者 联 合 评 估CAD 患者冠脉病变程度的曲线下面积分别为0.806（95%CI：0.695～0.917）、0.800（95%CI：0.689～0.911）、0.834（95%CI：0.737～0.932）、0.967（95%CI：0.930～1.000）。三者联合评估CAD 患者冠脉病变程度的曲线下面积高于单独评估（P均＜0.05）。见表5。

表5 血清miR-92a、miR-17、miR-19b表达对CAD患者冠脉病变程度的评估价值

3 讨论

研究表明，CAD 是多种危险因素作用于不同环节所致。冠脉AS 是CAD 发病的重要病理生理基础。miRNA 是一类由21～25 个核苷酸序列组成的存在于真核微生物中的保守单链非编码RNA，可参与心脏、肌肉等器官正常生长发育，其异常表达时亦可在心脑血管疾病的演变中扮演重要角色［11-12］。miRNA 可通过参与调控内皮细胞损伤、炎症反应、脂质代谢、血管平滑肌细胞增殖等过程，影响AS 发生发展［13］。近年来，miRNA 与心血管疾病的关系一直是备受关注的焦点问题。因此本研究选定3 个miRNA（miR-92a、miR-17、miR-19b），以探索其在评估CAD严重程度方面的价值。

本研究发现，CAD 组及CAD 患者高评分组中miR-92a、miR-17 高表达，而miR-19b 则低表达；且多因素Logistic分析显示，miR-92a、miR-17、miR-19b为CAD 发生的影响因素。表明在CAD 发生发展中miR-92a、miR-17 可能发挥着促AS 作用，而miR-19b则可能起到抗AS作用。

动物实验表明miR-92a 在糖尿病小鼠主动脉内皮细胞上呈高表达，拮抗miR-92a 表达可减轻血管内皮细胞氧化应激反应，进而起到血管保护作用［14］。LIU 等［15］证实，在小鼠老化血管内皮细胞中表达上调的miR-92a 可作用于Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1），上调Keap1 表达，同时也下调了核因子E2 相关因子2 或抗氧化反应元件的表达，进而加速内皮细胞衰老，引起内皮细胞功能障碍。本研究发现，CAD 患者血清中miR-92a 相对表达量高于对照组，且高评分组血清miR-92a 相对表达量高于低评分组，说明miR-92a 在CAD 患者血清中呈高表达，且参与冠脉病变进展。提示miR-92a 可能通过调控氧化应激、细胞衰老等过程参与CAD 进程，可能发挥着促AS 作用。动物实验发现，与正常小鼠相比，AS 模型小鼠巨噬细胞中miR-17 表达升高，且当给予AS 小鼠拮抗miR-17 处理后，炎症因子的产生及脂质堆积显著下调［16］。本研究发现，CAD患者血清中miR-17 相对表达量高于对照组，且高评分组患者血清miR-17 相对表达量高于低评分组，说明miR-17在CAD患者血清中呈高表达，并且随着冠脉病变进展而进一步增加。提示miR-17 可能通过调控炎症反应、脂质代谢等过程参与CAD 进展，亦可能发挥着促AS 作用。关于miR-19b，2017 年有报道称，miR-19b 可通过抑制细胞因子信号转导抑制剂（SOCS3）表达，促进下游炎症介质释放，加速AS发展［17］。但近年来关于miR-19b同CAD的相关研究较少且存在争议。有研究报道，miR-19b 在氧化型低密度脂蛋白诱导构建的人脐静脉血管内皮细胞AS 模型中呈低表达，而在正常血管壁内高表达，提示miR-19b 也可能与AS 的发生发展相关［18］。TANG等［19］也发现，升高miR-19b表达可抑制下游炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α所诱导的人脐静脉血管内皮细胞凋亡。SINGH等［20］研究进一步证实，在miR-19b低表达患者中发生心血管不良事件的风险愈高。而在本研究中证实CAD 组血清miR-19b 呈低表达，且随着患者病情进展而进一步降低，提示miR-19b 可能在CAD 中出现异常表达，且其低表达可能参与CAD病情加重。故我们推测，miR-19b 既可通过影响SOCS3信号因子表达来增加血管周围脂质组织炎症因子释放发挥促炎作用，又可通过凋亡酶激活因子-1/Caspase 信号通路发挥抑炎作用，但最终来说miR-19b 在CAD 发生发展发挥着抗AS 效应，但具体机制仍需进一步探索。

CAD 的严重程度与其病死率密切相关，因此对冠脉病变程度评估至关重要［21］。冠脉病变程度的量化可通过Gensini评分实现，这是临床上广泛使用的一种评分系统，其积分越高提示冠脉病变程度越重［22］。相关性分析显示，CAD 患者血清中miR-92a、miR-17 相对表达量与Gensini 积分呈正相关，miR-19b 相对表达量与Gensini 积分呈负相关，证明CAD患者血清中miR-92a、miR-17、miR-19b 相对表达量与患者病情严重程度相关。经ROC 曲线分析，得出三者联合检测AUC 为0.967 高于单项指标检测，说明联合检测对评估CAD患者病情进展效能更高。

综上所述，CAD 患者血清miR-92a、miR-17 表达升高，miR-19b 表达降低，均与患者冠脉病变程度相关。本研究局限性在于尚未探索上述miRNA 在CAD 发生发展中的具体作用机制，此外本研究样本量少，在未来仍需要大量样本来验证本结论。