马里苷对db/db小鼠肾脏组织内皮-间质转化和纤维化的改善作用及机制

张芳，郭琼，田亚婷，张博翔，李甜

1 新疆医科大学基础医学院，乌鲁木齐 830011；2 新疆医科大学第二临床医学院

糖尿病肾病（DN）是导致终末期肾病的主要原因，肾脏纤维化是糖尿病肾病的普遍病理特征，主要表现为细胞外基质的堆积［1］。研究证明，内皮-间质转化（EndMT）或上皮-间质转化（EMT）能够促进器官纤维化发生发展，其特征为内皮标志物（CD31）的表达下降和间充质标志物［纤维连接蛋白（Fibronectin）、波形蛋白（Vimentin）］的表达上升［2］。马里苷是一种黄酮类化合物，提取于功效独特的稀有高寒、野生植物两色金鸡菊，能够降血糖、调血脂，有抑制糖异生、改善糖尿病肾脏纤维化等功效，对延缓糖尿病肾病进程有潜在的价值［3-4］。然而马里苷对糖尿病肾脏纤维化和EndMT 作用相关的分子机制还有待进一步研究。成纤维细胞生长因子受体Ⅰ（FGFR1）属于受体酪氨酸激酶，其与配体成纤维细胞生长因子（FGF）结合后发挥生物学作用［5］。研究表明，FGFR1 可调节转化生长因子β（TGF-β），在器官纤维化过程中发挥重要作用［6］。马里苷与FGFR1 有较强的相互作用，推测FGFR1 与马里苷改善糖尿病肾脏纤维化有关［7］。2022 年，本研究以糖尿病瘦素受体基因缺陷小鼠（db/db 小鼠）为研究对象，探究马里苷对糖尿病db/db小鼠肾脏EndMT 和纤维化的改善作用及机制，为马里苷相关药物的研究与开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器

1.1.1 实验动物 选取6 周龄野生型瘦素受体基因缺陷杂合（db/m）正常雄性小鼠10只，体质量（16 ± 2）g；6 周龄自发性糖尿病db/db 雄性小鼠30 只，体质量（28 ± 2）g。小鼠均由江苏常州卡文思实验动物有限公司提供，生产许可号：SCXK（苏）2016-0010。小鼠饲养于新疆医科大学动物实验中心SPF级动物饲养室，单笼、单只饲养，自由饮水，每隔2 d 更换垫料。SPF动物饲养室模拟自然昼夜条件，日间相对温度（20 ± 2）℃，相对湿度（45 ± 5）%，每日日照时间为12 h，24 h 保持通风状态。饲养小鼠所使用的鼠笼、饲料、饮用水以及垫料均经过高温高压灭菌处理，按照国际动物保护相关指南和规定进行动物实验。

1.1.2 药物、主要试剂及仪器 马里苷购自法国Extrasynthese 公司；二甲双胍购自美国MCE 公司；Fibronectin、CD31 和FGFR1 基因引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成；兔抗Fibronectin、Vimentin抗体购自abcam贸易有限公司；兔抗CD31、GAPDH 抗体购自美国Affinity 公司；兔抗FGFR1 购自美国CST 公司；兔抗TGF-β、二抗IgG H&L/HRP购自博奥森生物技术有限公司；RNA 提取、逆转录和荧光定量PCR 试剂盒购自福际生物技术有限公司；垂直电泳槽购自美国Bio-Rad 公司；Applied BiosystemsTMQuantStudioTM6 and 7 Flex 实时定量PCR 仪购自美国Thermo Fisher Scientific 公司；拍照显微镜购自德国Leica公司。

1.2 动物分组及药物干预 取10 只db/m 小鼠作为正常对照组，按随机数字表法将30 只db/db 小鼠分为糖尿病模型组10 只、二甲双胍组10 只、马里苷组10 只。二甲双胍组给予二甲双胍280 mg/kg 灌胃、马里苷组给予50 mg/kg 马里苷组灌胃，正常对照组、糖尿病模型组均给予0.5%羧甲基纤维素钠0.2 mL/10 g灌胃，每日1次，共持续8周。各组均喂养转基因敲除小鼠饲料、基础饲料，正常饮水。

1.3 空腹血糖水平检测 第8 周末次给药后24 h，固定小鼠，用乙醇棉球消毒鼠巴后剪去一截，待鼠尾形成足够大的血珠时用血糖试纸吸取血珠，将血糖试纸插入罗氏血糖测量仪，记录空腹血糖。

1.4 肾组织中EndMT 标志物（Fibronectin、Vimentin、CD31）、纤维化指标（TGF-β）、FGFR1 蛋白表达检测 采用Western blotting 法。检测空腹血糖后麻醉小鼠，用断脊法将其处死后解剖，摘取双侧肾脏，用生理盐水清洗，并用滤纸将组织表面水分吸干。摘除肾脏表层包膜，沿纵向将肾脏组织均分，分别放于1.5 mL冻存管和4%多聚甲醛中固定。取出冻存于-80 ℃的小鼠肾脏组织，在研磨管内加入裂解液，用组织研磨仪进行研磨，每组研磨4～5次，每次40 s。研磨完成后将组织放置于冰上充分裂解30 min。随后将裂解产物离心12 000 r/min离心20 min（离心半径72 mm），吸取上清液，测定蛋白浓度。测定后每4体积蛋白上清液加入1体积4×loading buffer（含β-巯基乙醇，1%），100 ℃沸水水浴10 min。蛋白变性后，加样进行SDS-PAGE 凝胶电泳，转PVDF 膜。将PVDF 膜置于5%脱脂奶粉封闭，抗体孵育4 ℃过夜（1∶1 000的兔抗Fibronectin、Vimentin、CD31、TGF-β、FGFR1、GAPDH）。第2天TBST洗膜，随后加入酶标二抗（1∶5 000 的HRP 标记的山羊抗兔IgG）室温避光孵育50 min，TBST 洗膜后进行ECL 显色反应，曝光、显影图片存档，采用Image J 软件处理分析目的条带的灰度值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

1.5 肾组织中Fibronectin、CD31、FGFR1 mRNA 表达检测 采用RT-PCR 法。剪取肾组织样品置于研磨管内，研磨充分后进行振荡和离心，1 2 000 r/min离心20 min（离心半径72 mm），把离心后的水相层转移到新的离心管，根据试剂盒操作说明书，进行动物组织RNA 提取。测定RNA 浓度、纯度。将RNA逆转录成cDNA，行RT-PCR。反应体系：SYBR GreenⅠ标记底物混合液10 μL、cDNA 模板0.4 μL、上下游引物各0.8 μL、无酶水8 μL、ROX 0.4 μL，总体积20.4 μL。反应条件：预变性95 ℃ 5 min，循环中模板变性95 ℃ 10 s、退火55 ℃ 10 s、延伸72 ℃ 20 s共45 个循环。用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量。Fibronectin 上游引物5'-CTATAGGATTGGAGACACGTGG-3'，下 游 引 物5'-CTGAAGCACTTTGTAGAGCATG-3'；CD31 上游引物5'-CACAACAAACAAGCTAGCAAGA-3'，下 游 引 物5'-TTTGGCTGCAACTATTAAGGTG-3'；FGFR1 上游引物5'-AATGGATTCTGTGGTGCCTTCTGAC-3'，下游引物5'-GCTGGTAGGTGTGGTTGATGCTC-3'；GAPDH 上游 引 物5'-ACATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3'，下 游 引 物5'-AAGGTGGAAGAGTGGGAGTTG-3'。

1.6 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用独立样本LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组空腹血糖水平比较 第8 周正常对照组、糖尿病模型组、二甲双胍组、马里苷组空腹血糖水平分 别为（6.38 ± 0.68）、（30.10 ± 2.49）、（26.12 ± 3.26）、（26.90 ± 1.58）mmol/L。与正常对照组比较，糖尿病模型组空腹血糖水平高（P＜0.05）；与糖尿病模型组比较，二甲双胍组、马里苷组空腹血糖水平低（P均＜0.05）；二甲双胍组空腹血糖水平与马里苷组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 各组肾组织中Fibronectin、Vimentin、CD31、TGF-β、FGFR1蛋白表达比较 见表1。

表1 各组肾组织中Fibronectin、Vimentin、CD31、TGF-β、FGFR1蛋白表达比较（±s）

表1 各组肾组织中Fibronectin、Vimentin、CD31、TGF-β、FGFR1蛋白表达比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与糖尿病模型组比较，#P＜0.05；与二甲双胍组比较，&P＜0.05。

组别正常对照组糖尿病模型组二甲双胍组马里苷组n 6 6 6 6 Fibronectin蛋白1.00 ± 0.09 1.42 ± 0.14*0.97 ± 0.21#1.06 ± 0.16#Vimentin蛋白1.00 ± 0.12 2.08 ± 0.13*1.51 ± 0.26#1.19 ± 0.16#&CD31蛋白1.00 ± 0.06 0.79 ± 0.07*1.00 ± 0.18#0.94 ± 0.11#TGF-β蛋白1.00 ± 0.07 1.19 ± 0.12*0.96 ± 0.17#0.95 ± 0.15#FGFR1蛋白1.00 ± 0.08 2.34 ± 0.22*2.03 ± 0.38#1.69 ± 0.22#&

2.3 各组肾组织中Fibronectin、CD31、FGFR1 mRNA表达比较 见表2。

表2 各组肾组织中Fibronectin、CD31、FGFR1 mRNA表达比较（±s）

表2 各组肾组织中Fibronectin、CD31、FGFR1 mRNA表达比较（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与糖尿病模型组比较，#P＜0.05；与二甲双胍组比较，&P＜0.05。

组别正常对照组糖尿病模型组二甲双胍组马里苷组n 6 6 6 6 Fibronectin mRNA 1 2.62 ± 0.23*2.08 ± 0.10#1.74 ± 0.11#&CD31 mRNA 1 0.65 ± 0.03*0.84 ± 0.12#0.75 ± 0.01#&FGFR1 mRNA 1 1.92 ± 0.17*1.21 ± 0.06#1.32 ± 0.15#

3 讨论

糖尿病并发症严重影响患者的生活质量和预期寿命，给患者及社会带来了极大的医疗和经济负担［8］。器官纤维化的防治一直是糖尿病研究领域的重要课题。肾脏纤维化常见于糖尿病晚期，表现为肾组织中细胞外基质的过度沉积，最终导致肾脏功能衰竭［9］。糖尿病的高血糖、高血脂和胰岛素抵抗可通过触发上皮细胞和内皮细胞向成纤维细胞样表型转化，或者直接刺激成纤维细胞合成基质［10］，激活纤维化反应，但其中涉及的分子、基因及具体机制目前尚不清楚。目前主要集中于高糖环境刺激，造成活性氧的产生和生长因子的级联反应，诱导促炎因子和趋化因子聚集，产生糖基化终产物，最终上调纤维生成和基质细胞蛋白的表达［11］。马里苷是一种黄酮类化合物，能够抑制糖异生和改善胰岛素抵抗，调节机体血糖血脂紊乱，对改善和延缓糖尿病肾病进程有着潜在的应用价值［12］。已有研究表明，马里苷可有效保护糖尿病肾脏功能障碍以及肾小管和肾小球病变，但其对糖尿病肾脏纤维化的保护作用及相关分子机制还有待进一步研究［13］。 FGFR1 属于酪氨酸激酶家族受体，在血管生成、受伤组织修复以及能量代谢调节等方面扮演着十分重要的角色［14］。FGF 配体通过与细胞表面的FGFR 酪氨酸激酶发出信号，这些酪氨酸激酶在哺乳动物中由四种不同的基因编码。配体结合后诱导FGFR 二聚化，使细胞内受体激酶结构域相互接近和准确配位，从而使其发生磷酸化激活激酶。激活的受体激酶依次磷酸化和激活细胞内底物，主要是FGFR 底物2α（FRS2α）和磷脂酶Cγ1 （PLCγ1）。激活的FRS2α 通过RASMAPK 通路或PI3K-AKT 通路启动下游信号通路，从而发挥调节作用［15］。目前FGFR1 在癌症中的作用研究较多，EMT 或EndMT 是帮助癌细胞转移的重要途径。在小鼠前列腺中过表达FGFR1 可诱导前列腺上皮内瘤变，并且在该模型中，前列腺上皮内瘤变在1年内发展为移行性肉瘤样癌，提示发生了EMT。在化学诱导激活FGFR1 乳腺癌模型中，成年小鼠乳腺上皮中FGFR1 的激活诱导了MAPK 和AKT 依赖的癌细胞扩增，并最终导致浸润性乳腺病变，同样说明FGFR1 激活了EMT 促进癌细胞的侵袭、扩增［16］。此外在糖尿病背景下FGFR1 的作用也有较多研究［17-18］。在研究二甲双胍对糖尿病大鼠FGFR1表达的影响实验中，提示通过影响FGFR1作用于AKT 通路可改善高糖诱导的胰腺及脂肪组织的功能损伤［19］。研究表明，肾脏FGF23 和FGF2 从内皮细胞、足细胞、系膜细胞、间充质细胞和成纤维细胞中分泌，与肾脏FGFR1 受体结合，可促进内皮细胞和管状上皮细胞向间充质转化，从而加速肾组织间质累积和纤维化病变［20］。以上说明FGFR1 在糖尿病肾脏间质转化和纤维化病变中有关键作用，进一步探究其分子作用机制以及药物是否通过影响FGFR1改善糖尿病肾脏间质转化和纤维化有一定的研究价值。

本研究以糖尿病模型db/db 小鼠为研究对象，以二甲双胍为阳性对照。由各组第8 周空腹血糖检测结果看出，马里苷可有效降低db/db 小鼠的空腹血糖水平，对糖代谢紊乱有改善作用。在蛋白和基因水平，与正常对照组相比，糖尿病模型db/db 小鼠肾脏间质表型指标Fibronectin、Vimentin和纤维化指标TGF-β表达明显升高，内皮细胞标志物CD31表达明显下降，说明糖尿病模型组小鼠肾脏发生了End-MT 和纤维化，二甲双胍和马里苷可明显降低db/db小 鼠Fibronectin、Vimentin、TGF-β 的 表 达，上 调CD31表达，说明马里苷对db/db小鼠肾脏EndMT 和纤维化有一定的保护作用。此外，糖尿病db/db 小鼠肾组织FGFR1 分子表达上调，二甲双胍和马里苷给药后可降低FGFR1 的表达，说明马里苷可能通过降低FGFR1 的表达改善糖尿病肾脏EndMT 和纤维化。

综上所述，马里苷可改善糖尿病db/db 小鼠的肾脏EndMT 和纤维化，下调肾组织中FGFR1 表达。马里苷可能通过下调FGFR1发挥对糖尿病db/db小鼠的肾脏EndMT 和纤维化的治疗作用，但其中的通路还有待进一步研究。