李桑柔,刘超利,岳秀青,杨帆,陈睦虎,钟武
1 西南医科大学附属医院急诊医学部,四川 泸州 646000;2 四川省康复医院
血管平滑肌细胞(VSMC)根据细胞结构和功能的不同分为收缩型和合成型两种表型,收缩型表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)[1],向合成型转换时,高表达骨桥蛋白(OPN),导致血管壁张力降低,引发心血管疾病[2-3]。有研究表明,血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)引起的VSMC 表型转换可能是自噬依赖性的,适度的自噬可促进细胞增殖[4-6]。生物钟基因使生理活动在24 h 内表现出节律振荡[7]。Per2 作为转录抑制基因,表达生物节律性,低表达的Per2 抑制细胞自噬性凋亡[8-9]。2021 年4 月—2022 年9 月,本研究通过Ang Ⅱ诱导VSMC 发生表型转换,观察沉默Per2 和过表达Per2 对VSMC 表型转换的影响,进一步研究Per2在VSMC表型转换中的作用机制。
1.1 细胞、试剂及仪器 VSMC 购自武汉普诺赛生物科技有限公司。Ang Ⅱ购自北京索莱宝科技有限公司,辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG 购自上海碧云天生物技术有限公司,DMEM/F12 培养基购自美国Gibco 公司,胎牛血清、0.25% EDTA 胰蛋白酶、青霉素-链霉素、无血清细胞冻存液购自赛尔瑞成生命科学技术有限公司,PVDF 膜购自葆光生物技术有限公司,预染蛋白Marker 购自美国Thermo Fisher 公司,Per2 siRNA、riboFECTTMCP 转 染试 剂、pcDNA-Per2、pcDNA3.1-3xFlag-C(对照质粒)购自锐博生物科技有限公司,鼠一抗GAPDH、兔一抗β-actin、兔一抗OPN、兔一抗α-SMA、兔一抗Per2、兔一抗LC3、兔一抗p62 购自美国Proteintech 公司,BCA 蛋白浓度测定试剂盒、ECL 化学发光检测试剂盒、RIPA 裂解液、PMSF、蛋白质磷酸酶抑制剂购自阿斯本生物技术有限公司。
1.2 细胞培养 用含10%胎牛血清+1%青霉素-链霉素溶液+DMEM/F12培养基于5% CO2、37 ℃恒温孵箱中,选取传5~10代、状态良好的VSMC用于实验。
1.3 细胞转染 沉默Per2:将VSMC 接种于6 孔板,2×105/孔,将其随机分为Control A 组、siRNA 组、Per2 siRNA 组,分别给予常规培养、转染空载siRNA、转染Per2 siRNA。将细胞培养至30%~50%融合时,按说明书用riboFECTTMCP Buffer 稀释适量Per2 siRNA,再加入riboFECTTMCPReagent 制备成转染复合物,室温孵育15 min,加入无双抗完全培养基的6孔板中,37 ℃、5% CO2恒温孵箱中培养48 h。Per2过表达:将VSMC接种于6孔板,5×105/孔,将其随机分为Control B组、pcDNA组、pcDNA-Per2组,分别给予常规培养、转染空载pcDNA、转染pcDNA-Per2。将细胞培养至50%~70%融合时,转染前更换为无双抗完全培养基,将10 μL FTLipoTM加入250 μL基础培养基中室温孵育5 min,将4 μg 高质粒DNA-Per2 加入250 μL基础培养基混匀,将上述两种混合物混匀室温孵育20 min,加入6 孔板,37 ℃、5% CO2恒温孵箱中培养6 h,更换为完全培养基继续孵育48 h。用Western blotting法检测各组Per2蛋白表达以确认转染效率。
1.4 Ang Ⅱ干预 根据前期实验及参考文献[10]选择Ang Ⅱ最佳实验浓度为1×10-7mol/L、最佳干预时间为48 h。选择部分细胞随机分为Control C组、Ang Ⅱ组、Ang Ⅱ+Per2 siRNA 组,分别给予常规培养、1×10-7mol/L Ang Ⅱ处理48 h、先转染Per2 siRNA 后再加入1×10-7mol/L Ang Ⅱ处理48 h。另选部分细胞随机分为Control D 组、Ang Ⅱ组、Ang Ⅱ+Per2 siRNA 组,分别给予常规培养、1×10-7mol/L Ang Ⅱ处理48 h、先 转 染pcDNA-Per2 后 再 加 入1×10-7mol/L Ang Ⅱ处理48 h。
1.5 VSMC内Per2蛋白、表型转换相关蛋白(α-SMA、OPN)及自噬相关蛋白(p62、LC3)表达检测 采用Western blotting 法。取出培养箱中VSMC,移去培养基,4 ℃ PBS 洗涤2 次,加入适量的RIPA 冰上裂解30 min,12 000 r/min 离心15 min(离心半径10 cm),取上清液至1.5 mL EP 管中-20 ℃保存,采用BCA法测定蛋白浓度,根据上样量进行浓度调平,100 ℃煮沸5 min 进行蛋白变性,10 μg 蛋白上样并SDS-PAGE 凝胶电泳,转移至PVDF 膜上进行转膜,5%脱脂奶粉室温封闭2 h,TBST 洗涤1 次5 min,在脱色摇床上一抗(1∶1 000 稀释)4 ℃孵育过夜,TBST洗膜3 次,各10 min,室温孵育二抗(1∶1 000 稀释)1 h,TBST 洗膜3 次,各10 min,ECL 法显色,置于化学发光仪器中滴入适量ECL 发光液后曝成像,采用Image J 软件进行灰度定量分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白电泳条带灰度值/对应GAPDH 电泳条带灰度值。
1.6 统计学方法 采用GraphPad Prism8.0、SPSS26.0软件。符合正态分布的计量资料以±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 Per2 siRNA、pcDNA-Per2 的转染效率 Control A组、siRNA 组、Per2 siRNA 组Per2 蛋白相对表达量分 别 为0.448 ± 0.057、0.431 ± 0.043、0.245 ± 0.090,Per2 siRNA 组Per2 蛋 白 相 对 表 达 量 低 于Control B 组、siRNA 组(P均<0.05)。Control 组、pcDNA 组、pcDNA-Per2组Per2蛋白相对表达量分别为0.427 ± 0.059、0.432 ± 0.061、0.682 ± 0.063,pcDNA-Per2组Per2蛋白相对表达量高于Control组、pcDNA组(P均<0.05)。均转染成功。
2.2 沉默Per2 对表型转换相关蛋白及自噬相关蛋白表达的影响 见表1。
表1 沉默Per2对表型转换相关蛋白及自噬相关蛋白表达的影响(±s)
表1 沉默Per2对表型转换相关蛋白及自噬相关蛋白表达的影响(±s)
注:与Control C组比较,*P<0.05;与Ang Ⅱ组比较,△P<0.05。
组别Control C组Ang Ⅱ组Ang Ⅱ+Per2 siRNA组α-SMA 0.729 ± 0.075 0.180 ± 0.087*0.355 ± 0.026△OPN 0.200 ± 0.018 0.891 ± 0.041*0.691 ± 0.057△p62 0.631 ± 0.043 0.079 ± 0.022*0.198 ± 0.038△LC3 0.374 ± 0.106 0.676 ± 0.071*0.445 ± 0.024△
2.3 Per2 过表达对表型转换相关蛋白及自噬相 关蛋白表达的影响 见表2。
表2 Per2过表达对表型转换相关蛋白及自噬相关蛋白表达的影响(±s)
表2 Per2过表达对表型转换相关蛋白及自噬相关蛋白表达的影响(±s)
注:与Control D组比较,*P<0.05;与Ang Ⅱ组比较,△P<0.05。
组别Control D组Ang Ⅱ组Ang Ⅱ+pcDNA-Per2组α-SMA 0.673 ± 0.106 0.345 ± 0.066*0.158 ± 0.043△OPN 0.293 ± 0.081 0.437 ± 0.034*0.682 ± 0.041△p62 0.552 ± 0.079 0.325 ± 0.093*0.108 ± 0.016△LC3 0.239 ± 0.035 0.379 ± 0.062*0.503 ± 0.046△
VSMC 具有多样性,就功能而言存在合成型和收缩型两种表型,当细胞受到一定刺激时,为应对血管损伤,以收缩血管和调节血管的张力、血压和血流分布为主要功能的VSMC 向合成型发生转变,收缩型蛋白α-SMA、SM22-α 表达降低,合成型蛋白OPN表达升高,并分泌弹性蛋白酶、金属蛋白酶等,促使血管病变的发生,从而引起主动脉夹层、高血压、动脉粥样硬化、肺动脉高压、脑卒中等一系列疾病[11-12]。有研究表明,Ang Ⅱ作为肾素-血管紧张素-醛固酮系统的重要效应分子,可促进VSMC 细胞发生表型转换。Ang Ⅱ促进VSMC 表型转换可能是自噬依赖性的[13-14]。在心血管系统中,自噬抵抗外界环境改变对血管的损伤,参与调节细胞物质的合成,并且参与溶酶体降解衰老或者失去功能的细胞、细胞器和变性蛋白质等生物大分子,使降解和重新利用达到平衡,通过信号转导通路,如PI3K/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信号通路,表达自噬相关蛋白p62、LC3、Beclin1、ATG12 等[14],在营养、能量不足等病理条件下可以调控细胞物质的重新分配从而维持内环境的稳态[15-16]。然而,过度的自噬会导致内质网应激下病理状态下的细胞死亡,这种死亡是在生理状态下是清除无用的细胞和受损的蛋白质的一种保护机制,以维持自噬和细胞凋亡之间的平衡对于细胞发育至关重要[17]。
生物钟基因广泛存在于生物界,产生和控制各种生物的生理节律[9]。在哺乳动物中,生理节律的产生主要位于下丘脑视交叉上核,与调节昼夜节律的基因组成了中枢生物钟,适应全天不同时间不同活动水平的需求,并调节代谢、细胞增殖、生理和行为等各个方面[18-19]。其中基因Per是主钟基因,可编码多种蛋白质,若一个氨基酸被取代,就会使周期和转录循环发生改变[20]。生物钟基因Per2 是维持生物钟功能的重要转录抑制因子,研究发现,生物钟基因Per2 过表达通过PI3K-AKT-mTOR 通路激活细胞自噬,但这种影响是否同样存在于VSMC 中尚未被证实[21]。NONAKA 等[22]发现,小鼠主动脉中mPer2、Baml1 有明显的节律振荡,短暂给予Ang Ⅱ可引起mPer2 基因高表达,随后引起生物钟其他成分的同步周期性振荡。由此猜想,生物钟基因Per2 可能通过激活细胞自噬参与VSMC 表型转换。为了进一步探讨Per2 与表型转换的关系,本研究体外构建VSMC 表型转换模型,通过沉默及过表达Per2 研究Per2对自噬及Ang Ⅱ诱导VSMC表型转换的影响。
本研究采用Ang Ⅱ在体外诱导VSMC 发生表型转换,成功构建体外VSMC表型转换模型。与Ang Ⅱ处理VSMC 比较,转染Per2 siRNA 后Ang Ⅱ处理的VSMC,发现VSMC 表型转换、自噬的发生被抑制。而pcDNA-Per2 转染经Ang Ⅱ处理的VSMC 后,发现促进VSMC 表型转换及自噬的发生,再次验证过表达Per2促进自噬的发生,增强VSMC发生表型转换。
综上所述,Per2 在VSMC 表型转换中起重要作用。过表达生物钟基因Per2 激活细胞自噬,并促进Ang Ⅱ介导的VSMC 表型转换过程。因此,通过维持正常的生物节律并调控自噬抑制VSMC 表型转换的发生可能减缓血管病变的进展,同时为心血管疾病提供新的治疗靶点。本研究不足之处在于生物钟基因Per2 具有昼夜节律性,改变正常节律是否对自噬及Ang Ⅱ诱导VSMC 表型转换产生影响暂未明确;生物钟基因Per2 如何调控自噬从而影响VSMC表型转换需进一步研究证实。阐明生物钟紊乱对VSMC 发生病理生理改变的影响,对指导心血管疾病的治疗具有重大意义,未来的研究应关注这些不足,以提供更全面的结果。