温度和水活度对柏子仁黄曲霉毒素含量变化的影响

刘震营，王玲娜，姜 秋，蒲高斌，张永清

（山东中医药大学药学院，山东 济南 250355）

柏子仁为柏科植物侧柏Platycladus orientalis（L.）Franco 的干燥成熟种仁，具有养心安神、润肠通便、止汗等功效［1］。在中医药备受关注的新形势下，柏子仁市场需求量逐年增加，但因黄曲霉毒素含量超标造成质量不合格的报道层出不穷。黄曲霉毒素是由黄曲霉菌（Aspergillus flavus）与寄生曲霉菌（A.parasiticus）相互作用产生一类次级代谢产物。中药材容易受污染的黄曲霉毒素主要有黄曲霉 毒素B1（AFB1）、B2（AFB2）、G1（AFG1）和G2（AFG2）4 种。其中AFB1毒性最强，有严重的肝毒和致癌、致畸、致突变活性，属I 类致癌物［2］。

柏子仁经过机器加工时，很容易破碎，造成油脂外溢现象。在脂肪酸过氧化物存在下，黄曲霉毒素生物合成涉及脂质的氧化降解，且在脂肪酸存在下脂质过氧化和黄曲霉毒素合成均会加强［3］。柏子仁脂肪油含量可达48%，为黄曲霉菌生长及黄曲霉毒素产生提供有利条件［4］。在储藏方面，一般大都常温储藏，少数采用冷库，容易达到霉菌滋生和毒素产生的条件，需要严格控制环境条件。目前，关于柏子仁黄曲霉毒素的报道大都基于多种药材黄曲霉毒素的检测［5-7］。前人对水活度、温度影响中药材黄曲霉毒素积累的研究已经比较深入，不同基质黄曲霉毒素最易产生的条件具有明显差异［8-12］。本研究探讨不同水活度和温度条件下柏子仁黄曲霉毒素的产毒变化，寻找柏子仁在储藏等环节能够有限规避黄曲霉毒素产生的安全范围，有助于优化生产、加工、仓储条件，对柏子仁生产加工具有实践性指导意义。

1 材料

SPL-150 生化培养箱（天津莱玻特瑞仪器设备有限公司）；AW1000T 水分活度测定仪（上海昌琨实业有限公司）；ME204／02 万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；高效液相色谱-串联三重四级杆质谱联用仪（美国Agilent 公司）；5810R 高速离心机（德国Eppendorf 公司）；DHM-200 多管漩涡混合仪（宁波洛尚智能科技有限公司）；黄曲霉毒素免疫亲和柱（北京华安麦科生物技术有限公司）；MLS-3781L-PC 高压蒸汽灭菌 锅（日本Panasonic 公司）；Watson 177-112C 血球计数板（北京中西华大科技有限公司）；DM500 生物显微镜（德国Leica公司）。

PDA 培养基（北京索莱宝科技有限公司，批号320H031）；黄曲霉高产毒菌株BNCC142803（北京北纳创联生物技术研究院，批号18051821）；黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合对照品溶液（北京华安麦科生物技术有限公司，批号LRAC0310），质量浓度分别为1.0、0.3、1.0、0.3 mg／L。甲醇（分析纯，天津富宇精细化工有限公司）；吐温-20（北京索莱宝科技有限公司，批号505Q013）；吐温-80（国药集团化学试剂有限公司，批号20181205）；甲醇、甲酸（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific 公司）；溴化钾（批号20200526）、氯化钾（批号20191005）、氯化钡（批号20200509）、硫酸亚铁（批号20190504）、硝酸钾（批号20140414）、硫酸钾（批号20180504）（国药集团化学试剂有限公司）。

柏子仁收集于山东省济宁市汶上县柏子仁加工基地，均为当年产且未受黄曲霉毒素污染，经山东中医药大学张永清教授鉴定为柏科植物侧柏Platycladus orientalis（L.）Franco 的干燥成熟种仁。

2 方法

2.1 黄曲霉孢子悬浮液制备 将高产毒黄曲霉菌株BNCC142803 转接到PDA 培养基上，28 ℃生化培养箱中培养7 d，待菌落长满后用于后续黄曲霉孢子悬浮液制备。于超净工作台中用接种棒蘸取适量黄曲霉菌与1%吐温-80 混合，振荡摇匀，用无菌滴管吸取少量滴于血球计数板中，在显微镜下反复计数，制得密度为1×106／mL 的黄曲霉孢子悬浮液，备用。

2.2 水活度调节 水活度和温度是在综合黄曲霉菌繁殖生长及毒素产生条件，采用饱和盐溶液预平衡法获得目标水活度（0.80、0.85、0.90、0.92、0.94、0.98）［12-14］。选择相应的饱和盐溶液（溴化钾、氯化钾、氯化钡、硫酸亚铁、硝酸钾、硫酸钾）［15］，将不同种类盐分别放入干燥无菌培养皿中，向其中慢慢滴加水，直到完全溶解达到饱和状态，将培养皿分别置入干燥器下层（图1）。称取一定量柏子仁置于干燥无菌培养皿中，在超净工作台中紫外杀菌2 h 后置于干燥器上层，放上盖子，使其内部形成密闭空间，以达到不同目标的水活度。将所有干燥器放置在25 ℃恒温实验室内48 h 后，用水分活度测定仪测定。

图1 目标水活度调节示意图

2.3 接种培养 将达到目标水活度的柏子仁置超净工作台紫外杀菌2 h，称取80 g 放入已灭菌具塞锥形瓶中，加入3 mL黄曲霉孢子悬浮液，振荡，混匀，倒入培养皿，均匀铺开。然后置于事先设定好温度（20、25、28、32、36、40、42 ℃）并紫外灭菌2 h 的生化培养箱中培养7 d。每组实验均设置3 个平行样品。

2.4 黄曲霉毒素含量测定 称取8 g 培养7 d 后的柏子仁，于液氮中研磨。精密称取5 g，置50 mL 离心管中，加入1 g氯化钠和25 mL 70% 甲醇混匀，振荡，涡旋5 min，2 500 r／min 离心3 min，取10 mL 上清液，加入40 mL 1%吐温稀释，用快速定量滤纸过滤，收集滤液为上样液，待净化洗脱。取25 mL 上样液注入免疫亲和柱中，待液体排干后，用10 mL 水洗涤2 次，弃去全部洗脱液。待液体排干后，加入1 mL 甲醇洗脱，收集洗脱液并定容至1 mL。洗脱液用0.22 μm 微孔滤膜过滤，用于HPLC-MS／MS分析。

分析条件为HALO 90A C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流动相0.1% 甲酸（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～4 min，80%～62% A；4～10 min，62%～30% A；10～10.20 min，30%～0A；10.20～15 min，0～80% A）；柱温40 ℃；体积流量0.25 mL／min；进样量3 μL。电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描；多反应监测模式；干燥气温度300 ℃；干燥气体积流量10 L／min；毛细管电压4 000 V。4种黄曲霉毒素的相关质谱参数见表1。

表1 黄曲霉毒素质谱参数表

3 结果

3.1 温度对柏子仁黄曲霉毒素含量的影响 图2 显示温度对柏子仁AFB1含量变化的影响，在水活度0.80 时，20、25 ℃均不产生AFB1。28 ℃开始有AFB1产生，但含量相对较少，随着温度升高AFB1含量增加，至32 ℃时达到最大，然后逐渐降低，40 ℃时AFB1含量低于28 ℃。在水活度0.85 时，AFB1的产生趋势与水活度0.80 时相似，但初始产生温度从28 ℃降为25 ℃。在水活度0.90～0.92 时，均为25 ℃开始产生AFB1，且产毒量相对较高，至28 ℃便达到最高。在水活度0.94～0.98 时，AFB1最大产生量均发生在32 ℃，但25 ℃时水活度0.94 下AFB1产生量明显高于水活度0.98。

图2 温度对AFB1 含量的影响

对于AFB2，不同温度下含量不同（图3）。25 ℃时，水活度0.85、0.94、0.98 产毒最多。28 ℃时，水活度0.90 产毒最多；28～32 ℃区间不同水活度下均下降；36～42 ℃区间，水活度0.80、0.85、0.90、0.94 呈先上升后下降的趋势；42 ℃时，不同水活度均无AFB2产生。AFG1和AFG2在任何温度下均未检测到。

图3 温度对AFB2 含量的影响

随着温度升高，黄曲霉毒素总量呈现先上升后下降（图4）。20 ℃时，4 种黄曲霉毒素均未产生。随着温度升高，不同水活度条件下产毒量逐渐升高，28 ℃为水活度0.85、0.90、0.92 条件下最适产毒温度，其中在水活度0.90、0.92 时产毒量已超过2020 年版《中国药典》 规定标准。32 ℃为水活度0.80、0.94、0.98 时最适产毒温度，随着温度升高，黄曲霉毒素总量开始下降。在42 ℃，未产生黄曲霉毒素。

图4 温度对AFs 含量的影响

3.2 水活度对柏子仁黄曲霉毒素含量的影响 图5 结果显示不同水活度下AFB1含量的变化。在20、42 ℃时，均不会产生AFB1。25 ℃时，水活度0.80 无AFB1产生，水活度0.90 时AFB1产生量最多。28 ℃时，水活度0.80 产生AFB1但含量较低。AFB1均在水活度0.90 时含量最高，且25、28、32、36 ℃下产毒量已超过限量标准。

图5 水活度对AFB1 含量的影响

AFB2在不同水活度下含量不同（图6）。水活度0.85时，25、28 ℃条件下产毒最多。随着水活度不断升高，大部分温度条件下产毒量下降，其中在水活度0.92～0.98 区间，36、40 ℃条件下产毒量呈先升高后下降。AFG1和AFG2在任何水活度下均未检测到。

图6 水活度对AFB2 含量的影响

水活度对柏子仁AFs 的影响参见图7。随着水活度升高，黄曲霉毒素总量上升，水活度0.90 时，黄曲霉毒素总量最高，随温度升高下降。

图7 水活度对AFs 含量的影响

4 讨论

本研究检测4 种黄曲霉毒素，除低温和高温、部分低水活度条件外，均检出AFB1、AFB2。水活度作为黄曲霉菌产生黄曲霉毒素的一个测定指标，表示药材中的水与其他物质结合的紧密程度，是影响微生物生长的关键因素之一［16］。相比于水分含量，它能够反映产品储藏的稳定性，广泛用于药材质量与安全控制。

未来在柏子仁储存过程中，应重点防控AFB1和AFs的污染状况。在28 ℃、水活度0.90 时，柏子仁的黄曲霉菌产毒能力最强，毒素含量最高。在20、42 ℃时，水活度变化均不会产生黄曲霉毒素，推测这2 个温度点均限制与黄曲霉毒素产生相关基因的表达。一般选择低温储藏，高温储藏会促进其他真菌的繁殖生长。在水活度0.80 时，各温度条件下黄曲霉毒素产生量最低。由此可将20 ℃、水活度0.80 作为柏子仁黄曲霉毒素安全控制点。