产毒黄曲霉颉颃菌的筛选及复合菌剂的构建

■黎 欢 祁姣姣 彭玉莉 梁嘉旭 秦海啸 胡文锋1，*

（1.华南农业大学食品学院，广东 广州 510642；2.广东省食品药品职业技术学校，广东 广州 510663；3.生物源生物技术（深圳）股份有限公司，广东 深圳 518118）

霉菌具有繁殖速度快、孢子数量大、散布远等特点，因此农作物在其生长、收获、贮存和运输加工等过程中的各个环节均容易被霉菌污染[1]。霉菌毒素是某些霉菌在食品或饲料里生长所产生的代谢产物，对人类和动物的健康造成不同程度的危害[2]。研究表明，全球约有25%的谷物类粮食受到不同程度的霉菌毒素污染。霉菌毒素种类较多，主要有黄曲霉毒素、伏马毒素、呕吐毒素、赭曲霉毒、玉米赤霉烯酮毒素等。其中，黄曲霉毒素是毒性最强的一类致癌、致突变、致畸形的霉菌毒素，被世界卫生组织癌症研究机构划为ⅣA 级（Ⅰ类）危险物[3]。目前，已发现20 多种黄曲霉毒素，其中以AFB1 的毒性最强，毒性为氰化钾的10 倍，砒霜的68 倍[4]。对黄曲霉毒素的防控方法主要有物理脱毒、化学脱毒和生物脱毒等。

试验拟从土壤中分离筛选出对产毒黄曲霉具有高效颉颃作用的不产黄曲霉毒素的生防菌株，并初步探究其对黄曲霉颉颃的作用机理，创建高效防毒复合菌群，减少农作物在田间感染产毒黄曲霉，为从源头防控黄曲霉毒素污染奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

产毒菌株：黄曲霉GDMCC3. 18Aspergillus flavus。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）、马铃薯葡萄糖固体培养基（PDA）。

1.1.3 主要仪器设备高压蒸汽灭菌锅、旋涡混合仪、生化培养箱、低速离心机、双人单面净化工作台。

1.2 不产黄曲霉毒素的霉菌的分离纯化

参照张初署等[5]土壤样品采集方法采样，将土壤样品采用稀释涂布平板法进行分离[6-7]，具体方法如下：称取10 g土壤样品于90 mL灭菌生理盐水中充分振荡，制成10-1土壤悬液。采用10 倍系列稀释方法，依次制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6土壤悬液。分别取10-3、10-4、10-5、10-6梯度的土壤悬液100 μL 涂布于PDA 平板培养基上，每处理重复2 次，28 ℃黑暗条件下倒置培养5 d。挑取生长速度较快的菌落边缘的菌丝，接种于新的PDA平板培养基上，重复3～4次，以得到纯化的霉菌，4 ℃保存备用[8]。

将纯化菌株培养至第3 d的平板置于波长365 nm紫外灯下照射，观察菌落周围的培养基是否有蓝色或黄色荧光。若有荧光且较强，则舍去。若荧光较弱或无荧光，菌株继续培养，次日重复上述操作，直至第7 d[9]。

1.3 产毒黄曲霉颉颃菌的筛选

采用平板对峙法：将产毒黄曲霉接种于PDA 平板培养基上，28 ℃培养3 d。取直径约为5 mm 的菌块接种于PDA平板培养基上，菌块距培养基中心10～20 mm，在距产毒黄曲霉菌块约40 mm处放置初筛菌新鲜菌株菌块，以在PDA 平板中央接种约5 mm 的产毒黄曲霉菌块为对照组，28 ℃培养7 d，每处理重复2 次。观察接种3、5、7 d产毒黄曲霉菌与颉颃菌的生长状况[10]。利用CAD软件对培养至第7 d的对峙结果计算抑制率。

颉颃菌对产毒黄曲霉的抑制率（%）=（对照产毒黄曲霉的生长面积-对峙培养产毒黄曲霉生长面积）/对照产毒黄曲霉生长面积×100。

1.4 初筛菌的鉴定

1.4.1 形态学鉴定

待初筛菌菌丝长成菌落后，采用透明胶带法[11]制成临时装片，于光学显微镜下观察菌丝、孢子等形态。对照真菌鉴定手册对初筛菌进行初步鉴定[12-13]。

1.4.2 分子生物学鉴定

对产毒黄曲霉抑制率最高的初筛菌，通过ITS 基因（ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）序列进行分子鉴定[14]。必要时将该菌株进行保种。

1.5 初筛菌发酵液对产毒黄曲霉生长的影响

选取生长速度快、抑制效果较好的4株霉菌，编号为A-1、A-2、F-501和Q-281分别接种于PDA平板培养基上，28 ℃培养3 d。活化后的4株霉菌分别接种于含有50 mL PDB 培养基的三角瓶中，28 ℃、180 r/min摇床避光培养3 d。取发酵液于3 500 r/min 离心5 min，获得发酵上清液，保存备用。

用接种环挑取少许产毒黄曲霉孢子于1 mL无菌水中，充分振荡，制成孢子悬液。移取500 μL孢子悬液于100 mL约45 ℃PDA培养基中，充分混匀。移取20 mL PDA 培养基于灭菌培养皿内，充分凝固后，移取5 mL含黄曲霉孢子的PDA培养基于底层平板上迅速铺平，待凝固。每个平板放置4 个牛津杯，10 min后分别加入4 株菌株的发酵液，加液量与杯口水平，每处理重复2次。28 ℃培养3 d后观察产毒黄曲霉受抑制的情况[15]。

1.6 初筛菌的相互作用

处理方法如1.5 所述，28 ℃培养3 d 后观察各菌株之间的相互作用效果。

1.7 复合菌剂的构建

依据初筛菌生长特性及彼此之间相互作用等因素，确定3 株菌株制备复合菌剂。采用L9（43）正交试验，以菌株A-1 孢子悬液（A）、菌株A-2 孢子悬液（B）、菌株Q-281孢子悬液（C）为考察因素，每个因素下设置3个水平，以对产毒黄曲霉的抑制率为考核指标，进行复合菌剂配方的构建，具体正交试验因素及水平如表1所示。操作方法如下：

表1 正交试验因素水平表

将3 株菌株及产毒黄曲霉分别接种到PDA 斜面试管培养基上，28 ℃恒温培养5～7 d。分别向试管中加入5 mL无菌水，将霉菌孢子刮下，倒入装有无菌水的三角瓶，置于摇床振荡1.5 h[16]。血球计数板计数孢子数，用无菌水将其稀释到所需浓度，备用。

1.8 复合菌剂对产毒黄曲霉产毒的影响

称取完整无破损的玉米粒30 g 置于三角瓶中，121 ℃灭菌30 min。向三角瓶中加入300 μL 最优复合菌剂及300 μL 1×105个/mL 的产毒黄曲霉孢子悬液，轻轻摇晃，使孢子悬液覆盖到玉米粒上。以三角瓶中加入300 μL 无菌水及300 μL 1×105个/mL 的产毒黄曲霉孢子悬液为对照组，每处理重复2 次，并于28 ℃，黑暗条件下培养14 d。试验结束后，将玉米粒于121 ℃灭菌30 min。采用免疫荧光层析法测定其AFB1的含量。

2 结果与分析

2.1 初筛菌产黄曲霉毒素能力的快速检测

从土壤样品筛选分离得到的4株菌株A-1、A-2、F-501和Q-281在PDA平板培养基上培养的第3 d至第7 d，在365 nm紫外灯照射下菌落周边的培养基均无荧光。

2.2 平板颉颃对峙试验（见表2、图1）

图1 初筛菌与产毒黄曲霉对峙结果

表2 初筛菌株对产毒黄曲霉生长的抑制率(%)

通过平板对峙测定，分离得到的4株霉菌均对产毒黄曲霉的生长具有一定的颉颃能力。在对峙3 d后，分离菌株的生长速度明显超过产毒黄曲霉。A-1、A-2、F-501 和Q-281 对产毒黄曲霉的抑制率分别为51%、66%、61%和53%。

2.3 初筛菌的鉴定（见表3、图2）

图2 初筛菌菌株形态特征及镜检图

表3 初筛菌的形态特征

4 株初筛菌的形态特征等各不相同，其形态特征分别似木霉、曲霉和青霉。对产毒黄曲霉生长抑制率最高的菌株为A-2，ITS rDNA 扩增序列长度为577 bp，将A-2的序列结果通过与核酸序列库中的序列进行对比发现，A-2与绿木霉的同源性为100%，结合其形态学特点，确定A-2菌为绿木霉。

2.4 初筛菌发酵液对产毒黄曲霉生长的作用（见表4）

表4 初筛菌株发酵液对产毒黄曲霉的生长影响

A-1的发酵液对产毒黄曲霉的生长有抑制效果，抑菌圈直径为18.00 mm，其余4株菌株的发酵液对产毒黄曲霉没有抑制效果。

2.5 初筛菌之间相互作用（见表5）

表5 初筛菌发酵液对其余初筛菌生长的影响

A-1发酵液对Q-281的生长有抑制作用，抑菌圈直径为8.12 mm。A-2发酵液对A-1和F-501的生长有抑制作用，抑菌圈直径均为10.52 mm。F-501发酵液对A-1的生长有抑制作用，抑菌圈直径为12.22 mm。

2.6 复合菌剂对产毒黄曲霉生长的抑制作用（见表6、图3）

图3 复合菌剂与产毒黄曲霉的对峙结果

表6 正交试验表及结果

9 组试验结果表明，复合菌群对产毒黄曲霉的抑制率均大于等于63%，7 组试验组比单一菌剂作用产毒黄曲霉的抑制率高，其中A1B3C3组合对产毒黄曲霉生长的抑制作用最强，抑制率达到73%。

2.7 复合菌剂对产毒黄曲霉产毒的影响（见表7）

由表7 可知，产毒黄曲霉在玉米培养基上培养，AFB1 含量为4.85 ng/g；在此基础上添加复合菌剂，AFB1含量为1.23 ng/g，对AFB1的抑制率为75%。

表7 复合菌剂在玉米培养基上抑制AFB1生成的效果

3 讨论

本研究从土壤样品中分离得到4 株对产毒黄曲霉有明显抑制作用的不产毒霉菌，抑制效果依次为A-2（66%）＞F-501（61%）＞Q-281（53%）＞A-1（51%）。在平板对峙中，初筛菌F-501、Q-281与产毒黄曲霉之间没有明显的界限，甚至是初筛菌覆盖了产毒黄曲霉，A-1、A-2 与产毒黄曲霉之间有一条透明带，猜测可能是因为初筛菌的分泌物对产毒黄曲霉生长有抑制作用。徐杨玉等[17]研究发现，木霉能产生多种抗生素、酶等颉颃性物质抑制病原真菌。但在初筛菌发酵液对产毒黄曲霉生长的抑制试验中，A-2的发酵液对产毒黄曲霉的生长没有抑制作用，可能是因为A-2在液体培养中的接种量较少，以至发酵液中的活性物质少，尚未达到抑制产毒黄曲霉生长的最低下限。菌株A-1、A-2可能除了与产毒黄曲霉竞争空间营养外，其分泌物对产毒黄曲霉生长也具有抑制作用。其余2 株初筛菌可能是在生长营养空间上对产毒黄曲霉进行抑制作用。

本研究还探究了分离菌之间的相互作用，这为构建更高效防毒的复合功能菌剂提供了一定的理论支持。菌株A-1 发酵液对产毒黄曲霉有较强的抑制作用，将A-1列入复合菌剂配方中。菌株Q-281发酵液对其余初筛菌没有抑制作用，将Q-281列入复合菌剂配方中。菌株F-501 发酵液对A-1 有较强的抑制作用，舍去F-501。菌株A-1 与菌株A-2 为同一土壤样品中筛选出来的霉菌，为使得所配复合菌剂能在相互制约动态平衡下，对产毒黄曲霉生长有最大抑制效果，故最终选取A-1、A-2、Q-281 3 株初筛菌创建复合菌剂。从平板对峙结果来看，有7组复合配方对产毒黄曲霉的生长抑制效果比单菌株A-2 的抑制效果要好。在玉米等谷物中，加入最优复合菌剂，AFB1含量由4.85 ng/g 下降为1.23 ng/g，抑制率达75%。由此可见，复合菌剂能高效抑制产毒黄曲霉的生长和AFB1的生成。

谷物等农作物被黄曲霉及其毒素污染严重，从源头上有效抑制产毒黄曲霉生长及其产毒已成为研究热点。而在黄曲霉毒素的生物防治方法中，探究单一菌株抑制产毒黄曲霉生长及产毒的研究较多，但是相关复合菌剂的研究较少。该复合菌剂中包含木霉及青霉，木霉在生物防治手段中已被广泛研究及利用。本复合菌剂配伍后，是否会有其他毒素的生成，还需要进一步研究。而周璞等[18]发现，利用干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌及产阮假丝酵母制备复合益生菌对AFB1 的降解率为49.58%，而本研究中构建的复合菌剂对产毒黄曲霉的抑制率达75%。若在此基础上添加某些益生菌，是否能使复合菌剂更加稳定可靠，更大效果地降解AFB1，并将其余可能产生的毒素一并吸附降解，值得深入探讨。

4 结论

本研究分离得到的4 株对产毒黄曲霉生长具有抑制作用的霉菌，其抑制率均大于50%。经鉴定其分别为木霉（A-1、A-2）、曲霉（F-501）、青霉（Q-281）。由A-1、A-2、Q-281孢子浓度分别为1×104、1×106、1×106个/mL 组建的复合菌剂，对AFB1 生成的抑制率高达75%，抑制效果显著高于单一菌剂。