芹菜素磷脂复合物纳米混悬剂制备及其体内药动学研究

宋文颖，于雅琴

（珠海科技学院，广东 珠海 519041）

芹菜素属于黄酮类化合物，大量存在于橘子、洋葱、欧芹、柑橘等植物中［1］，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、降血压、心肌保护等活性［1-3］，开发价值大，但该成分溶解度仅为1.35 μg／mL［4］，并且溶出度低，体内易受胃肠道酶、pH 值的影响［5］，导致其口服吸收困难。目前，已有关于芹菜素固体分散体［4］、磷脂复合物［4］、固体脂质纳米粒［6］等方面的研究，但固体分散体或磷脂复合物改善吸收程度有限［4］，而固体脂质纳米粒往往存在载药量较低等问题。

纳米混悬剂可提高难溶性药物的溶解度、溶出度、生物利用度等参数［7-9］，应用潜力较大，于世龙［10］采用二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂制备芹菜素纳米混悬剂，但它难以除去，而且具有一定毒性［11］，影响了推广价值。本实验采用磷脂复合物增加芹菜素在有机溶剂（如乙醇）中的溶解度，可为后续其纳米混悬剂的制备奠定基础［4，12］，并且磷脂复合物一般存在黏性大、溶出度低、生物利用度提高程度受限等问题［13-14］，而将其进一步制成纳米混悬剂后可有效解决这些缺陷，能为后续相关研究提供新思路。

1 材料

SQP 型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；08-2G 型恒温加热磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）；安捷伦1200 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；Master-sizer 型粒度分析仪（英国马尔文仪器有限公司）；ATS 型均质机（加拿大SEEKER 公司）；MIX-2500 型涡旋混合器（常州金坛良友仪器有限公司）；HNDK400 型氮气吹扫仪（上海达洛科学仪器有限公司）；BCD-206TAS 型冰箱（青岛海尔股份有限公司）。

芹菜素对照品（批号191105，纯度98%，南京青泽医药科技开发有限公司）；芹菜素原料药（批号Y190915，纯度96.5%，山东永信中和生物科技有限公司）。磷脂酰胆碱（批号20191012，上海辅必成医药科技有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS，批号20200124，国药集团化学试剂有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP K30，批号250015427，美国Ashland 公司）。

清洁级SD 大鼠，体质量（240±20）g，雌雄兼具，购于河南省动物实验中心，动物生产许可证号SCXK（豫）2016-0001。

2 方法与结果

2.1 纳米混悬剂制备 参考文献［12，14］报道，采用高压均质法。取芹菜素原料药100 mg、磷脂300 mg，置于烧杯中（摩尔比约1∶1），加入50 mL 乙酸乙酯制成混悬液，50 ℃水浴磁力搅拌至溶液澄清（约2.5 h），减压旋蒸除去乙酸乙酯，加入5 mL 无水乙醇复溶，作为有机相；称取处方量PVP K30、泊洛沙姆188，溶于100 mL 蒸馏水中，加热至50 ℃，作为水相，将有机相加到水相中，减压旋蒸10 min 后在一定压力下循环均质数次，蒸馏水定容至100 mL，过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.2 HPLC 法测定芹菜素含量

2.2.1 色谱条件 Agilent-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；体积流量水-甲醇（70∶30）；体积流量1.0 mL／min；柱温30 ℃；检测波长340 nm；进样量20 μL。理论塔板数以芹菜素计，不低于6 500。

2.2.2 线性关系考察 精密称取芹菜素对照品适量，甲醇制成每1 mL 含100 μg 该成分的对照品溶液，流动相依次稀释至20、10、5、0.5、0.1、0.05 μg／mL，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝24.147 2X－9.425 7（r＝0.999 9），在0.05～20 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.2.3 供试品溶液制备 取1 mL 纳米混悬剂，置于100 mL 量瓶中，甲醇超声溶解并定容，过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.2.4 方法学考察 取供试品溶液适量，室温下于0、4、8、12、24、48 h 在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得芹菜素峰面积RSD 为0.19%，表明溶液在48 h 内稳定性良好。取20、5、0.05 μg／mL 对照品溶液适量，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得芹菜素含量RSD 分别为0.24%、0.31%、0.23%，表明仪器精密度良好。取纳米混悬剂适量，按“2.2.3” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得芹菜素含量RSD 为1.40%，表明该方法重复性良好。取0.5 mL 纳米混悬剂，置于100 mL 量瓶中，平行9 份，分为高、中、低3 组，分别加入对照品溶液（100 μg／mL）6、5、4 mL，再加入甲醇超声溶解并定容，过0.45 μm 微孔滤膜，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得芹菜素平均加样回收率分别为100.87%、99.46%、99.03%，RSD 分别为0.74%、1.19%、0.63%。

2.3 粒径、PDI、Zeta 电位测定 取纳米混悬剂0.5 mL，蒸馏水稀释30 倍，混匀后取适量至比色皿中，在粒度分析仪上测定。

2.4 单因素试验

2.4.1 稳定剂用量 固定PVP K30 与泊洛沙姆188 比例为1∶1，均质压力为100 MPa，均质次数为8 次，考察稳定剂用量50、100、150、200 mg对粒径、PDI、Zeta 电位的影响，结果见表1。由此可知，当稳定剂用量较小时，粒径、PDI 较高，Zeta 电位绝对值较低；随着用量增加，粒径、PDI逐渐降低，Zeta 电位绝对值逐渐升高，但过大时粒径、PDI 反而又有升高趋势。最终，选择稳定剂用量为150 mg。

表1 稳定剂用量对粒径、PDI、Zeta 电位的影响（n＝3）Tab.1 Effects of stabilizer consumption on particle size，PDI and Zeta potential（n＝3）

2.4.2 PVP K30 与泊洛沙姆188 比例 固定稳定剂用量为150 mg，均质压力为100 MPa，均质次数为8 次，考察PVP K30 与泊洛沙姆188 比例对粒径、PDI、Zeta 电位的影响，结果见表2。由此可知，当PVP K30 用量逐渐增加时，粒径、PDI 先降低后升高；当两者比例为1∶2 时，粒径、PDI较低，Zeta 电位绝对值较高。最终，选择PVP K30与泊洛沙姆188 比例为1∶2。

表2 PVP K30 与泊洛沙姆188 比例对粒径、PDI、Zeta电位的影响（n＝3）Tab.2 Effects of PVP K30-Poloxamer 188 ratio on particle size，PDI and Zeta potential（n＝3）

2.4.3 均质压力 固定稳定剂用量为150 mg，PVP K30 与泊洛沙姆188 比例为1∶2，均质次数为8 次，考察均质压力对粒径、PDI、Zeta 电位的影响，结果见表3。由此可知，随着均质压力增加，粒径、PDI 先降低后升高；当均质压力为110 MPa 时，PDI、Zeta 电位绝对值与100 MPa 时相比差异不大，但粒径低于200 nm。最终，选择均质压力为110 MPa。

表3 均质压力对粒径、PDI、Zeta 电位的影响（n＝3）Tab.3 Effects of homogenization pressure on particle size，PDI and Zeta potential（n＝3）

2.4.4 均质次数 固定稳定剂用量为150 mg，PVP K30 与泊洛沙姆188 比例为1∶2，均质压力为110 MPa，考察均质次数对粒径、PDI、Zeta 电位的影响，结果见表4。由此可知，随着均质次数增加，粒径、PDI 先降低后升高；当均质次数为10 次时，粒径、PDI 较低，Zeta 电位绝对值较高。最终，选择均质次数为10 次。

表4 均质次数对粒径、PDI、Zeta 电位的影响（n＝3）Tab.4 Effects of homogenization frequency on particle size，PDI and Zeta potential（n＝3）

2.5 验证试验 根据单因素试验结果，确定最优制备工艺为取芹菜素100 mg、磷脂酰胆碱300 mg，置于烧杯中，加入50 mL 乙酸乙酯制成混悬液，50 ℃水浴磁力搅拌至溶液澄清（约2.5 h），减压旋蒸除去乙酸乙酯得熔融液，加入5 mL 无水乙醇复溶，作为有机相；以PVP K30 与泊洛沙姆188比例为1∶2 共取150 mg，溶于100 mL 蒸馏水中，加热至50 ℃后加到熔融液中，立即在110 MPa 均质压力下循环均质10 次，过0.45 μm 微孔滤膜，即得。平行制备3 批样品，按“2.3” 项下方法测得平均粒径为193.51 nm（图1），PDI 为0.172，Zeta 电位为－36.48 mV（图2）。

图1 芹菜素磷脂复合物纳米混悬剂Zeta 电位Fig.1 Zeta potential of nanosuspensions of apigenin phospholipids complex

图2 芹菜素磷脂复合物纳米混悬剂粒径分布Fig.2 Particle size of nanosuspensions of apigenin phospholipids complex

2.6 载药量测定 取1 mL 纳米混悬剂至100 mL量瓶中，甲醇超声溶解并定容，过0.45 μm 微孔滤膜，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，计算芹菜素含量M1；取1 mL 纳米混悬剂，在－30 ℃下预冻2 d 后在－20 ℃下真空冷冻干燥1 d，称定粉末质量M0，计算载药量，公式为载药量＝（M2／M1）×100%。结果，3 批样品平均载药量为18.02%。

2.7 冻干粉制备 课题组前期考察了不同冻干保护剂（甘露醇、乳糖、蔗糖）、用量（4%、5%、6%、7%）对粒径、外观的影响，发现以6%甘露醇为冻干保护剂时粒径增加程度最小，外观饱满。取纳米混悬剂混悬液适量，加入6% 甘露醇，在－30 ℃下预冻2 d 后在－20 ℃下真空冷冻干燥1 d，于3 h 内将温度缓慢升高至25 ℃，取出，即得，外观见图3，蒸馏水复溶后，测得其平均粒径为257.23 nm，PDI 为0.240，Zeta 电位为－31.75 mV。

图3 冻干粉外观Fig.3 Appearance of lyophilized powder

2.8 稳定性考察 取纳米混悬剂及其冻干粉适量，置于恒温恒湿箱中（温度25 ℃，相对湿度60%），于0、5、10、15、30、45、60 d 取样，测定冻干前后粒径、Zeta 电位，结果见表5。由此可知，纳米混悬剂放置60 d 后粒径变大，Zeta 电位绝对值变小，而将其制成冻干粉后两者变化趋势明显变缓，表明冻干有助于提高其稳定性。

表5 稳定性考察结果（n＝3）Tab.5 Results of stability investigation（n＝3）

2.9 体外释药研究 取原料药、磷脂复合物、纳米混悬剂、物理混合物（比例同纳米混悬剂）粉末适量（芹菜素含量均为4 mg），加入5 mL 1%SDS 溶液制成混悬液［15］，置于活化后透析袋中（截留分子量8 000～14 000 Da），细尼龙绳扎紧两端，以1 000 mL 1.5% SDS 溶液为介质，在温度（37±1）℃、转速100 r／min 下于0、0.15、0.3、0.5、0.45、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h 各取样3 mL，并补加3 mL 空白溶出介质，0.45 μm 微孔滤膜过滤，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，计算累积溶出度，结果见图4。由此可知，原料药12 h 内累积溶出度为21.84%，而磷脂复合物提高至42.16%，纳米混悬剂更达94.53%，表明虽然物理混合物累积溶出度有所提高，但仍明显低于纳米混悬剂。

图4 芹菜素体外释药曲线（n＝3）Fig.4 In vitro drug release curves for apigenin（n＝3）

2.10 体内药动学研究

2.10.1 灌胃液制备 取原料药、磷脂复合物、纳米混悬剂冻干粉适量，0.5%CMC-Na 溶液制成混悬液，即得（以芹菜素计，质量浓度为8 mg／mL）。

2.10.2 分组、给药与采血 18 只大鼠禁食12 h后随机分为3 组，每组6 只，按60 mg／kg 剂量给予“2.10.1” 项下灌胃液，原料药、磷脂复合物组于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10 h 眼眶静脉丛取血各约0.3 mL 至肝素化离心管中，纳米混悬剂组增加12 h 取血点，取血期间补充适量生理盐水，全血3 000 r／min 离心2 min，取上层血浆至空白离心管中，标记后密封，置于－20 ℃冰箱中。

2.10.3 血浆处理 参考文献［4］报道，血浆室温缓慢解冻后吸取0.1 mL，置于离心管中，依次加入10 μL 冰醋酸、1.5 mL 甲醇，涡旋振荡3 min，6 000 r／min 离心6 min，吸取上清液，45 ℃氮气缓慢吹除有机溶剂得残留物，加入0.1 mL 甲醇涡旋复溶，6 000 r／min 离心6 min，进样分析。

2.10.4 血浆对照品溶液制备及线性关系考察 取芹菜素对照品适量，甲醇制成8、4、1、0.5、0.1、0.05 μg／mL 溶液，分别精密取0.1 mL，45 ℃氮气缓慢吹除甲醇，残留物加入0.1 mL 空白血浆，即得血浆对照品溶液，按“2.10.3” 项下方法处理，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程为Y＝0.452 7X－2.361 4（r＝0.993 4），在0.05～8 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.10.5 方法学考察 取空白血浆、血浆对照品溶液（0.05 μg／mL）、磷脂复合物灌胃给药10 h 后的血浆样品适量，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图5，可知色谱峰分离度理想，方法专属性良好。制备0.5 μg／mL 血浆样品，于0、3、6、12、18、24 h 在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，测得芹菜素峰面积RSD 为1.94%，表明样品在24 h 内稳定性良好。取高（8 μg／mL）、中（1 μg／mL）、低（0.05 μg／mL）质量浓度血浆对照品溶液，分别在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得芹菜素峰面积RSD 分别为7.52%、10.61%、8.04%，表明仪器精密度良好。取空白血浆适量，甲醇制成8、1、0.05 μg／mL 溶液，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，并与配制时的质量浓度进行比较，即为方法回收率，结果分别为90.07%、91.24%、93.19%，RSD 分别为7.11%、3.08%、5.93%。取8、1、0.05 μg／mL 血浆对照品溶液及相同质量浓度的对照品溶液适量，在“2.2.1” 项色谱条件下进样测定，计算两者峰面积比值，即为萃取回收率，结果分别为96.33%、93.07%、94.26%，RSD 分别为7.02%、4.73%、6.65%。

图5 芹菜素HPLC 色谱图Fig.5 HPLC chromatograms of apigenin

2.10.6 结果分析 绘制血药浓度-时间曲线，再采用3P97 程序统计矩模型计算主要药动学参数（tmax、t1／2采用非参数法秩和检验，Cmax、AUC 经对数转换后采用t检验），结果见图6、表6。由此可知，与原料药比较，磷脂复合物t1／2延长（P＜0.05），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），相对生物利用度提高至1.73 倍；与原料药、磷脂复合物比较，纳米混悬剂tmax缩短（P＜0.05），t1／2延 长（P＜0.01），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升 高（P＜0.01），相对生物利用度增加至4.88 倍。

表6 芹菜素主要药动学参数（±s， n＝6）Tab.6 Main pharmacokinetic parameters for apigenin（±s， n＝6）

表6 芹菜素主要药动学参数（±s， n＝6）Tab.6 Main pharmacokinetic parameters for apigenin（±s， n＝6）

注：与芹菜素比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与芹菜素磷脂复合物比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

图6 芹菜素血药浓度-时间曲线（n＝6）Fig.6 Plasma concentration-time curves for apigenin（n＝6）

3 讨论

前期考察发现，单独采用某一种稳定剂时纳米混悬剂粒径一般在300 nm 以上，分布范围较大；将PVP K30 与SDS 联用后，纳米混悬剂粒径较小，可能是由于前者分子链较长，伸展后可形成较大的空间阻力［16-17］，而后者是表面活性剂，有助于降低纳米混悬剂粒径，而且也可提供空间位阻作用［18］。于世龙［10］采用DMSO 作为溶剂，制备的芹菜素纳米混悬剂在31 d 内粒径增加了2 倍多（冻干前），可能是由于纳米混悬剂中DMSO（难以除去）影响了制剂稳定性所致。本实验引入磷脂复合物后，提高了芹菜素在无水乙醇中的溶解度［4］，无需使用DMSO 即可制成纳米混悬剂，并且冻干前放置60 d 后其粒径仅增加了37.57%。

结果显示，芹菜素磷脂复合物纳米混悬剂tmax显著延长，可能是由于纳米混悬剂加快了药物释放，缩短了入血时间；累积释放度大大增加，从而使Cmax显著升高；相对生物利用度增加至4.88 倍，除了与纳米混悬剂促进药物释放、提高累积溶出度有关外，还可能涉及纳米混悬剂增强药物对肠道黏膜的黏附性、间接促进吸收、纳米药物经淋巴循环等途径进入血液循环等因素［19］，从而使药动学参数发生很大变化［20］。但最终纳米混悬剂中芹菜素是以磷脂复合物的形式存在，还是以游离芹菜素的形式存在，或是两者兼有尚不明确，仍需进一步研究，并且后续还要继续完善其质量标准、注射药动学、药效评价等方面的考察。