良附滴丸中挥发性成分组成分析及含量测定

廖永娥潘 洁陆 苑刘春花孙 佳汪 洋李勇军*

（1.贵州医科大学，民族药与中药开发应用教育部工程研究中心／省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学药学院，贵州 贵阳 550004； 3.贵州医科大学，贵州省药物制剂重点实验室，贵州 贵阳 550004）

良附滴丸源自传统名方良附方，由高良姜、香附组成，具有温胃散寒、理气止痛之功效，用于治疗寒凝气滞、脘腹胀满、疼痛吐酸［1］，临床上应用于急慢性胃炎、胃溃疡等疾病，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、止血、镇痛等作用［2-5］。前期研究表明，良附滴丸中主要含有挥发油、黄酮［6］，但对前者报道较少，物质基础仍不明确，而且该制剂质量标准仅收录了高良姜中高良姜素的含量测定项目，无法全面反映其整体质量。因此，考察挥发性成分对良附滴丸药效物质基础阐释与质量标准提升非常重要。

由于挥发油沸点低，具有挥发性，目前大多采用气相色谱（GC）或气相色谱-质谱联用（GCMS）法进行分析，而在无对照品的情况下，气相色谱-三重串联四极杆质谱联用（GC-MS／MS）法可实现对未知化合物分子离子、碎片离子的分析，用于定性检测时更准确可靠。因此，本实验首先采用GC-MS／MS 法对良附滴丸挥发性成分组成进行分析，通过数据库结合文献检索来推测结构，并进一步利用已知成分的对照品对结构进行比对，再建立多指标成分含量测定方法，以期为该类成分药效物质基础研究奠定基础，同时也为该制剂质量标准提升提供参考。

1 材料

1.1 仪器 GC-MS-TQ8050 气相色谱-三重串联四极杆质谱联用仪（日本岛津公司）；AE-240 电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；ALLEGRA X-30R 匀速离心机（美国 Beckman Coulter 公司）；CQ250A-TS 超声波清洗机（上海跃进医用光学器厂）。

1.2 试剂与药物 良附滴丸按照标准制备工艺，由课题组自制（批号分别为S1-20210920、S2-20210924、S3-20210928）。桉叶油醇、芳樟醇、（－）-4-萜品醇、α-松油醇、石竹素、桃金娘烯醇对照品（批号分别为AF20032351、AF20072551、AF20081504、AF20081520、AF20112202、AF2108 1005，纯度＞98%，成都埃法生物科技有限公司）；D-樟脑对照品（批号AF21120651，纯度＞95%，成都埃法生物科技有限公司）；苯丙醛、苄基丙酮对照品（批号C12861588、C12940513，纯度＞95%，上海麦克林生化科技有限公司）；香附烯酮对照品（批号20120705，纯度＞98%，四川省维克奇生物科技有限公司）；α-香附酮对照品（批号S1007AS，纯度＞98%，大连生物技术有限公司）；萘对照品（批号21050063，纯度＞98%，坛墨质检-标准物质中心）。乙酸乙酯为分析纯（天津市北辰方正试剂厂）。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液 精密称取桉叶油醇、D-樟脑、芳樟醇、（－）-4-萜品醇、α-松油醇、苯丙醛、桃金娘烯醇、苄基丙酮、石竹素、香附烯酮、α-香附酮对照品适量，乙酸乙酯制成质量浓度分别为1.146、0.968、1.360、1.188、1.040、1.007、1.005、1.046、0.946、1.000、1.001 mg／mL 的贮备液，再用乙酸乙酯逐级稀释成系列质量浓度，即得。

2.1.2 内标溶液 精密称取萘对照品10 mg，置于10 mL 量瓶中，乙酸乙酯定容至刻度，得质量浓度为1 mg／mL 的贮备液，精密吸取0.5 mL 至25 mL 量瓶中，乙酸乙酯稀释至5 μg／mL，即得。

2.1.3 供试品溶液 取本品适量，研细，精密称取100 mg，加入100 μg／mL 内标溶液0.6 mL，乙酸乙酯定容至100 mL，称定质量，超声处理10 min，乙酸乙酯补足减失的质量，混匀，吸取5 mL，12 000 r／min 离心10 min，取上清液，即得。

2.2 GC-MS／MS 分析条件

2.2.1 色谱 SH-StabiLwax 毛细管色谱柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；程序升温（40 ℃保持2 min，10 ℃／min 升至100 ℃，4 ℃／min 升至155 ℃，3 ℃／min 升至180 ℃，10 ℃／min 升 至190 ℃保持1 min，30 ℃／min 升 至230 ℃保 持6 min）；进样口温度220 ℃；载气氦气，体积流量6 mL／min；不分流；进样量1 μL。

2.2.2 质谱 电子轰击离子源；离子源温度200 ℃；接口温度230 ℃；检测器电压0.2 kV；溶剂延迟时间3 min；扫描模式Q3SCAN（用于组成分析）、Q3SIM（用于含量测定，具体见表1）；扫描范围m／z30～300。

表1 Q3SIM 模式条件Tab.1 Q3SIM mode conditions

2.3 挥发性成分组成分析 取样品（S1）适量，相关数据通过NINST20 谱图库进行检索，选择匹配度高于80 的色谱峰，并结合相关文献推测结构，结果见表2。由此可知，共检测出76 个化合物，其相对峰面积含量占挥发油总量的83.02%，其中来源于高良姜的共53 个，来源于醋香附的共43个，两者共有峰20 个。再进一步与对照品比对后确定了11 个，分别为桉叶油醇、D-樟脑、芳樟醇、（－）-4-萜品醇、α-松油醇、苯丙醛、桃金娘烯醇、苄基丙酮、石竹素、香附烯酮、α-香附酮，以苄基丙酮（26.34%）、苯丙醛（16.85%）、香附烯酮（4.96%）、桉叶油醇（3.45%）、香附子烯（3.17%）、α-松油醇（2.66%）为主。

表2 良附滴丸中挥发性成分Tab.2 Volatile constituents in Liangfu Dropping Pills

2.4 挥发性成分含量测定

2.4.1 系统适用性试验 取供试品、对照品溶液适量，在“2.2” 项条件下进样测定，结果见图1，可知各挥发性成分的分离度均大于1.5。

图1 各挥发性成分GC-MS／MS 总离子流图Fig.1 GC-MS／MS total ion current chromatograms of various volatile constituents

2.4.2 线性关系考察 取“2.1.1” 项下系列质量浓度对照品溶液，在“2.2” 项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），对照品、内标峰面积比值为纵坐标（Y），通过加权最小二乘法进行线性回归（权重系数1／X），并以信噪比S／N ＝3 为检测限（LOD），S／N ＝10 为定量限（LOQ），结果见表3，可知各挥发性成分在各自范围内线性关系良好。

表3 各挥发性成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various volatile constituents

2.4.3 精密度试验 取“2.4.2” 项下对照品溶液适量，在“2.2” 项条件下进样测定6 次，测得桉叶油醇、D-樟脑、芳樟醇、（－）-4-萜品醇、α-松油醇、苯丙醛、桃金娘烯醇、苄基丙酮、石竹素、香附稀 酮、α-香附酮峰面积RSD 分别为1.5%、0.42%、0.67%、0.79%、0.34%、0.15%、0.97%、0.41%、0.39%、0.54%、0.95%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 精密称取同一批本品100 mg，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，于0、1、2、4、8、12 h 在“2.2” 项条件下进样测定，测得桉叶油醇、D-樟脑、芳樟醇、（－）-4-萜品醇、α-松油醇、苯丙醛、桃金娘烯醇、苄基丙酮、石竹素、香附稀酮、α-香附酮峰面积RSD 分别为2.8%、2.6%、1.8%、2.5%、2.7%、1.7%、2.9%、2.4%、2.2%、2.8%、2.8%，表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.4.5 重复性试验 精密称取同一批本品100 mg，共6 份，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项条件下进样测定，测得桉叶油醇、D-樟脑、芳樟醇、（－）-4-萜品醇、α-松油醇、苯丙醛、桃金娘烯醇、苄基丙酮、石竹素、香附稀 酮、α-香附酮峰面积RSD 分别为2.7%、2.3%、2.6%、2.2%、2.5%、2.0%、1.9%、2.0%、2.6%、0.99%、1.9%，表明该方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 精密称取同一批本品6份，每份50 mg，以重复性试验中的平均含量为基准测定各挥发性成分含量，按1∶1 比例加入对照品溶液，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项条件下进样测定，计算回收率。结果，桉叶油醇、D-樟脑、芳樟醇、（－）-4-萜品醇、α-松油醇、苯丙醛、桃金娘烯醇、苄基丙酮、石竹素、香附稀酮、α-香附酮平均加样回收率分别为95.24%、100.80%、98.50%、100.88%、99.84%、100.27%、95.93%、104.36%、104.27%、99.73%、96.77%，RSD 分别为2.96%、2.88%、2.97%、2.93%、1.50%、2.66%、2.88%、2.39%、1.66%、2.68%、2.45%。

2.4.7 样品含量测定 精密称取3 批本品，每批3 份，每份100 mg，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.2” 项条件下进样测定，计算含量，结果见表4。

表4 各挥发性成分含量测定结果（%， n＝3）Tab.4 Results of content determination of various volatile constituents（%， n＝3）

3 讨论

课题组前期发现，良附滴丸具有显著的抗胃溃疡作用，其机制与降低炎症反应介质MDA、TNFα、IL-6 水平，提高机体NO、SOD、PGE2 等胃黏膜保护因子水平有关［1］。研究表明，良附滴丸中香附子烯［7-8］、α-香附酮、香附烯酮［9-10］、桉叶油醇、α-松油醇、芳樟醇［11-12］、（－ ）-4-萜 品醇［13-14］、桃金娘烯醇［15］、β-石竹烯［16-17］等挥发油均具有抗炎、抗氧化损伤等药理活性，故推测良附滴丸中该类成分也可能是其抗胃溃疡作用的潜在药效物质基础。

4 结论

本实验基于GC-MS／MS 法，首先采用Q3SCAN模式对良附滴丸挥发性成分进行定性分析，结果共检测出酮类、醛类、萜类、醇类、烃类等共76 种，其相对峰面积含量占挥发油总量的83.02%，其中苄基丙酮、苯丙醛含量最高，与文献［18］报道一致。因此，选择良附滴丸主要挥发性成分苄基丙酮、苯丙醛、D-樟脑，以及可能发挥药效的成分桉叶油醇、芳樟醇、（－）-4-萜品醇、α-松油醇、桃金娘烯醇、石竹素、香附烯酮、α-香附酮作为指标，建立了基于SIM 扫描模式的GC-MS／MS 法测定其含量，该方法重复性好，专属性强，可用于该制剂的质量控制。