芪楼丸通过调控JAK／STAT 信号通路对人肝癌HepG2 细胞增殖与凋亡的影响

康 莉，李 波，王晓栋，吴 莉，刘友平，魏 嵋*

（1.西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000； 2.西南医科大学基础医学院，四川 泸州 646000）

原发性肝癌是指起源于肝细胞或肝内胆管上皮细胞的恶性肿瘤，包括肝细胞癌、肝内胆管癌和肝细胞癌-肝内胆管癌混合型3 种不同的病理类型。目前临床治疗原发性肝癌，早期主要以手术治疗为主，中晚期采用微创治疗、全身化疗和分子靶向治疗等，但依然面临术后复发率高，放、化疗和分子靶向治疗带来的副作用问题［1-2］。而中医临床根据肝癌本虚标实、虚实夹杂的特点，以扶正祛邪，标本兼治，恢复肝主疏泄之功能为治疗原则，使气血运行流畅，湿热瘀毒之邪外排，从而缓解病情［3］。随着我国肝癌日均诊治费用逐年增长，在充分发挥中医药防治肝癌优势的基础上，寻找到更具疗效、副作用小、经济实惠，且能在有效控制病灶复发及转移情况下提高患者生存质量的治疗方法，变得尤为重要。

芪楼丸是全国名老中医孙同郊教授治疗肝癌的经验方，该方主要药材有十余种，其中包括黄芪、重楼、女贞子、墨旱莲、莪术、白术等，具有益气养阴、扶助正气、祛邪解毒抗癌等功效。本课题组前期临床观察及动物实验证实芪楼丸能够有效提高大多数原发性肝癌患者免疫功能，延长生存期，改善生活质量［4-5］。本实验将以肝癌细胞为对象进行实验，深入探讨芪楼丸治疗肝癌的相关分子机制，为芪楼丸的开发奠定良好的实验基础。

1 材料

1.1 药物 芪楼丸由西南医科大学附属中医医院制剂室提供，所含药材经本院制剂室蒲清荣主任中药师鉴定为正品，将其制作成1.76 g／mL 的浸膏。

1.2 实验动物 SPF 级雄性SD 大鼠40 只，体质量250～375 g，由成都达硕实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（川）2018-17，饲养于西南医科大学动物实验中心，实验动物使用许可证号SYXK（川）2018-065，实验经西南医科大学动物伦理委员会审批通过（编号SWMU 20210387）。

1.3 细胞 人肝癌HepG2 细胞株，由赛百慷（上海）生物技术股份有限公司提供，使用含10%FBS、1% 青-链霉素的DMEM 培养液，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，按1∶2 比例传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.4 试剂 DMEM 高糖培养基（以色列Biological Industries 公司，批号2123159）；胎牛血清（德国PAN-Biotech 公司，货号ST30-3301）；Annexin-V／FITC 凋亡试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号20210531）；CCK-8 试剂盒（日本同仁化学研究所，货号CK04）；RT 试剂盒、PCR 反应液［东洋纺（上海）生物科技有限公司，货号FSQ-201、QPK-201］；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司，货号PP1001）；GAPDH 内参抗体（美国Santa Cruz 公司，货号SC-32233）；JAK2、STAT3、STAT5、p-JAK2、p-STAT3 一抗及羊抗兔IgG-HRP 二抗（江苏亲科生物研究中心有限公司，批号22v9316、15x8824、88j7342、75d7669、74m1478、56j9958）；ELISA 试剂盒（泉州市睿信生物科技有限公司，批号06／2021）。

1.5 仪器 生物安全柜（济南鑫贝西生物技术有限公司）；CO2培养箱（上海天棋制药机械有限公司）；倒置荧光显微镜（日本Nikon 公司）；全波长酶标仪（美国Bio-Rad 公司）；流式细胞仪（美国BD 公司）；化学发光成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司）；电泳仪及附件（北京凯元信瑞仪器有限公司）。

2 方法

2.1 含药血清制备 大鼠随机分为对照组（生理盐水10 mL／kg）和芪楼丸低、中、高剂量组（6.75、13.5、27 g／kg），每组10 只，每天早晚各给药1 次，连续灌胃5 d，于末次给药后1 h，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠（40 mg／kg）进行麻醉，腹主动脉取血，室温下静置2 h，离心后取上清液，于56 ℃水浴灭活30 min，经0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得含药血清，于－80 ℃冰箱中保存待用。

2.2 CCK8 法检测细胞增殖抑制率 取对数生长期HepG2 细胞，调整密度为5×104／mL，接种于96孔板，每孔100 μL，分为空白组（无细胞，仅100% DMEM 培养液）、对照组（含细胞，100%DMEM 培养液）和芪楼丸低、中、高剂量组（含细胞，90% DMEM 培养液＋10% 各组含药血清），每组6 个复孔，待细胞贴壁后，加入对应培养液，分别孵育24、48、72 h，弃去培养液，每孔加入90 μL 完全培养基、10 μL CCK-8 溶液，继续培养2 h，用酶标仪检测其在450 nm 波长处光密度值，计算细胞增殖抑制率。

2.3 Annexin-V／PI 双染法检测细胞凋亡情况 取对数生长期HepG2 细胞，调整密度为5×104／mL，接种于6 孔板，每孔2 mL，分为对照组（100%DMEM 培养液）和芪楼丸低、中、高剂量组（90%DMEM 培养液＋10%各组含药血清），每组3个复孔，培养箱培养24 h，分别加入对应培养液继续培养72 h，离心收集细胞，重悬后用冷PBS 溶液进行洗涤，去除上清液，向其中加入1×Binding Buffer 悬浮细胞，取出1×105个细胞，分别向其中加入5 μL Annexin V／FITC 和5 μL PI／PE 溶液，暗室中避光振荡15 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

2.4 RT-qPCR 法检测细胞Bax、Bcl-2 mRNA 表达 取对数生长期HepG2 细胞，于6 cm 培养皿中（5×107个／皿）培养贴壁后，分为对照组（无细胞，仅100%DMEM 培养液）和芪楼丸低、中、高剂量组（90%DMEM 培养液＋10%各组含药血清），每组3 个复孔，培养24 h 后提取各组细胞总RNA，按照RT-qPCR 试剂盒说明逆转录成cDNA，然后进行扩增反应。以β-actin为内参，通过2－ΔΔCT法计算各目的基因mRNA 相对表达。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.5 ELISA 法检测细胞Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9 水平 取对数生长期HepG2 细胞，接种于24 孔板，每孔1×105个，分为对照组（100%DMEM 培养液）和芪楼丸低、中、高剂量组（90% DMEM培养液＋10%各组含药血清），每组6 个复孔，于培养箱中培养24 h 后分别加入对应培养液继续培养48 h，离心收集细胞，重悬后用冷PBS 洗涤，1 200 r／min 离心5 min，弃上清，沉淀加裂解液裂解30 min，每5 min 振荡1 次，4 ℃、12 000 r／min离心15 min，取上清，－20 ℃保存备用。按照ELISA 试剂盒说明书检测细胞裂解液中Bax、Bcl-2、caspase-3 和caspase-9 水平。

2.6 Western blot 检测细胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、STAT5 蛋白表达 取对数生长期HepG2细胞，接种于6 孔板，分为对照组（100% DMEM培养液）和芪楼丸低、中、高剂量组（90%DMEM培养液＋10%各组含药血清），每组3 个复孔，待各孔细胞融合度达80%～90%时分别加入对应培养液继续培养72 h，离心收集细胞，PBS 洗涤，加入RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r／min离心15 min，取上清液，BCA 法测定蛋白浓度，蛋白变性后分装置于－80 ℃冰箱保存。蛋白样本进行凝胶电泳、转膜，用5%脱脂奶粉溶液封闭1 h，TBST 溶液洗膜，加入一抗JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、STAT5、GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST 溶液洗涤，加入二抗（1∶4 000），室温孵育1 h，TBST 溶液洗涤，加入ECL超敏发光液，用凝胶成像仪对条带进行显影，以GAPDH 为内参，对目的蛋白相对表达量进行分析。

2.7 统计学分析 通过SPSS 24.0 软件进行处理，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 芪楼丸含药血清对HepG2 细胞增殖抑制率的影响 如图1 所示，与对照组比较，随药物剂量增加及处理时间的延长，HepG2 细胞增殖抑制率逐渐升高（P＜0.01），表明芪楼丸含药血清能抑制HepG2 细胞增殖，且呈剂量和时间依赖性。

图1 芪楼丸含药血清对HepG2 细胞增殖的影响（±s， n＝6）Fig.1 Effects of Qilou Pills-containing serum on HepG2 cell proliferation（±s， n＝6）

3.2 芪楼丸含药血清对HepG2 细胞凋亡的影响如图2～3 所示，与对照组比较，芪楼丸中、高剂量组细胞凋亡率升高（P＜0.01），并呈剂量依赖性。由此可见，芪楼丸含药血清可促进HepG2 细胞的凋亡。

图2 各组细胞凋亡情况Fig.2 Cell apoptosis in each group

3.3 芪楼丸含药血清对HepG2 细胞Bcl-2、BaxmRNA 表达的影响 如图4 所示，与对照组比较，芪楼丸中、高剂量组细胞BaxmRNA 表达升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA 表达降低（P＜0.01），并呈剂量依赖性。

图3 芪楼丸含药血清对HepG2 细胞凋亡的影响（±s，n＝3）Fig.3 Effects of Qilou Pills-containing serum onapoptosis of HepG2 cells（±s， n＝3）

图4 芪楼丸含药血清对HepG2 细胞Bcl-2、 Bax mRNA 表达的影响（±s， n＝3）Fig.4 Effects of Qilou Pills-containing serum on the mRNA expressions of Bcl-2 and Bax in HepG2 cells（±s， n＝3）

3.4 芪楼丸含药血清对HepG2 细胞凋亡因子的影响 如图5 所示，与对照组比较，芪楼丸各剂量组细胞caspase-3、caspase-9、Bax 水平均升高（P＜0.01），Bcl-2 水平均降低（P＜0.01）。

图5 芪楼丸含药血清对HepG2 细胞caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2 水平的影响（±s， n＝6）Fig.5 Effects of Qilou Pills-containing serum on the levels of caspase-3，caspase-9，Bax and Bcl-2 in HepG2 cells（±s， n＝6）

3.5 芪楼丸含药血清对HepG2 细胞JAK／STAT 信号通路关键蛋白表达的影响 如表2、图6 所示，与对照组比较，芪楼丸各剂量组JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、STAT5 蛋白表达随药物浓度升高而下降（P＜0.01）。

图6 各组细胞JAK2、STAT3、STAT5、p-JAK2、p-STAT3 蛋白条带图Fig.6 Protein bands of JAK2，STAT3，STAT5，p-JAK2 and p-STAT3 in each group of cells

表2 芪楼丸含药血清对HepG2 细胞JAK2、STAT3、STAT5、p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达的影响（±s， n＝3）Tab.2 Effects of Qilou Pills-containing serum on the protein expressions of JAK2，STAT3，STAT5，p-JAK2 and p-STAT3 in HepG2 cells（±s， n＝3）

表2 芪楼丸含药血清对HepG2 细胞JAK2、STAT3、STAT5、p-JAK2、p-STAT3 蛋白表达的影响（±s， n＝3）Tab.2 Effects of Qilou Pills-containing serum on the protein expressions of JAK2，STAT3，STAT5，p-JAK2 and p-STAT3 in HepG2 cells（±s， n＝3）

注：与对照组比较，**P＜0.01。

4 讨论

肿瘤的发生和发展是一个复杂的过程，涉及到多种因素、多个阶段、多个环节，与机体本身和外部环境均有一定关系［6］。目前已知肿瘤细胞的失控性快速生长与细胞的凋亡下调有关。JAK／STAT信号通路是调控细胞增殖与凋亡的重要通路，尤其在肿瘤，如肝癌、结肠癌等实体肿瘤的发生发展中起到关键作用［7］。细胞因子和表面的受体相结合，从而使受体二聚化，促进和受体关联的JAK 家族发生聚集反应，刺激JAK 激酶的激活。当JAK 激酶激活后，会使受体中的STAT 蛋白产生磷酸化反应，从而使STAT 蛋白被激活后离开受体进入细胞核中，在细胞核中对基因的调控产生影响。因此，JAK 激酶和STAT 蛋白的表达会对细胞增殖、凋亡等活动产生影响［8］。已有研究证实，人肝癌组织中JAK2、STAT3、STAT5 活化水平明显高于癌旁组织，其中磷酸化STAT3（p-STAT3）水平越高，预后越差［9-11］，其机制主要为STAT3 信号激活后可诱导下游抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1 等表达增加，促凋亡蛋白Bax、Bak 和凋亡效应因子caspase-3、caspase-9 表达降低，从而对细胞增殖产生影响，并抑制细胞凋亡来传递致癌信号［12-13］。大量研究证明，部分中药单体可调控JAK2、STAT3、STAT5蛋白表达来抑制肝癌细胞增殖，促进肝癌细胞凋亡［14-15］。但目前关于中药复方基于JAK／STAT 信号通路作用于原发性肝癌的相关报道较为少见，仍需进一步探究。

芪楼丸由黄芪、重楼、女贞子、墨旱莲、莪术、白术等十余味中草药组成，是孙同郊教授研发治疗中晚期肝癌的经验方。孙同郊教授认为当原发性肝癌患者的病程到达中晚期时，其病理表现主要为“虚实夹杂、本虚标实”，其中本虚指的是气虚和阴虚，标实指的是淤血和热毒胶结，而淤血存在于肝癌发生发展的整个过程。该方黄芪为补气类代表药，其含有的活性成分能够调节免疫功能，提高细胞因子活性，从而起到增强免疫的作用［16］；重楼可活血化瘀、清热解毒，其有效成分重楼皂苷Ⅰ可抑制肝癌细胞增殖和迁移［17］，此二药并用为君，可针对肝癌病机中虚实两端，发挥攻补兼施作用。女贞子、墨旱莲入肝肾经，二者协同作用，可通过多靶点、多通路对肝癌产生治疗作用［18］；莪术苦泄辛散温通，其含有姜黄素类、莪术二酮等单体成分具有很好的抗炎、抗肿瘤等药理作用［19］，此三味为臣药，共凑活血化瘀，清热解毒之功。佐以白术等药材，有助于增强“脾气”，起到调理肠胃、提高免疫力等功能［20］。纵观全方，扶正与祛邪并重，强调“留得一分正气，便存得一分生机”。

本实验表明，芪楼丸能降低Bcl-2 mRNA 表达和Bcl-2 水平，升高BaxmRNA 表达和 Bax、caspase-3、caspase-9 水平，且有效抑制了JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、STAT5 蛋白表达，提示芪楼丸能抑制人肝癌HepG2 细胞增殖，促进其凋亡，其机制可能与通过调节JAK／STAT 信号通路有关。