糖尿病肾病肾小管上皮细胞上皮-间充质转化的机制研究进展

宁小娅,丁涵露

(1.遵义医科大学,贵州 遵义 563000;2.四川省医学科学院·四川省人民医院肾内科,四川 成都 610072)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种世界性的健康挑战,其发生率在过去的数十年里迅速上升。根据国际糖尿病联合会的数据显示,在2021年的时候,全世界DM患者总数超过5.0亿人(20～79岁人群),而预计到2045年,这一数字可能将急剧上升至接近8.0亿[1]。糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是DM最常见的微血管并发症,影响多达30%的1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1DM)患者和40%的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者[2]。此外,DN已成为众多慢性肾脏病中导致终末期肾脏病(end stage renal disease,ESRD)的重要因素,给患者带来了极大的威胁。越来越多的研究表明,肾小管损伤和进行性间质纤维化与DN的进展更为密切相关。肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cell,RTEC)上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)对DN患者肾纤维化的启动和促进至关重要。现将DN中TEC的EMT的发病机理的研究进展做一综述。

1 EMT概述

EMT是在一系列信号通路及细胞因子的刺激下,上皮细胞向间充质细胞转变的一个极其动态的过程。其转变的特征表现为细胞间接触的消失,基底膜的破坏,上皮钙黏素和紧密连接蛋白-1的丧失,蛋白质网络的重构,还有新的间充质标志物的出现,如α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白、I型胶原蛋白和纤维连接蛋白等。EMT可以分为三种不同的类型:1型EMT可以促进胚胎发育和器官形成,2型EMT则可以引起炎症和器官纤维化,而3型EMT则可以促进肿瘤的发展[3]。多项研究显示,EMT在DN的病理中起主导作用,其中2型EMT与DN肾纤维化密切相关。

2 EMT与DN肾纤维化

进行性肾间质纤维化被认为是DN的标志性病理特征,表现为I型和IV型胶原、层粘蛋白和纤维连接蛋白等细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白成分在小球系膜和小管间质过度蓄积。肌成纤维细胞是肾间质纤维化发生演变的关键,它们在正常肾脏中极为罕见,因此,它们的出现可以被视为肾间质纤维化的开端。目前,肌成纤维细胞的来源仍然不完全清楚,但可能的前体细胞包括常驻间充质细胞、骨髓来源细胞、周细胞、内皮细胞和上皮细胞等。越来越多的证据表明,TEC不仅是损伤的受害者,也是肾脏疾病进展的驱动力。TEC损伤后,可能出现EMT或部分EMT、细胞周期阻滞和细胞衰老,并分泌促纤维化细胞因子,从而刺激肌成纤维细胞活化,导致纤维化的产生[4]。目前,越来越多的研究证明,TEC的EMT能够促进ECM蛋白成分的表达,在DN间质纤维化的病理中起着关键作用。EMT的分子机制是十分复杂的,许多信号通路和中介物相互影响共同调节这一过程。

3 DN中EMT的不同发病机制

3.1 信号通路与EMT

3.1.1转化生长因子-β(TGF-β)/Smad信号通路 TGF-β是一种多样的转化生长因子,包含三种不同的亚型:TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3,其中TGF-β1被证明是参与肾纤维化形成的关键因子,并被证明是EMT最有效的诱导剂。其通过Smad依赖(典型)和Smad非依赖(非典型)信号通路导致ECM过度蓄积和纤维化形成,以Smad依赖信号通路最为重要。Smad2和Smad3是TGF-β1最为重要的下游介质,它们在肾脏纤维化的发生过程中发挥着不同的生物学作用,甚至相互拮抗。Smad2通过抑制TGF-β1/Smad3信息通路,阻止了TGF-β1引起的肾纤维化,进而起到肾脏保护作用,而Smad3则可以促进肾脏纤维化的发生,加重肾脏疾病进展[5]。Smad7被称为抑制性Smad,它是TGF-β信号转导的负性调节因子,在肾脏保护中起着重要作用。Wang等[6]的实验发现,下调Smad7可促进TGF-β1介导的EMT,从而加重DN的肾损害。骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein 7,BMP7)属于TGF-β超家族成员,它被认为是一种有效的抗纤维化因子。Peng等[7]研究发现,在DN中,BMP7可能通过下调TGF-β1/Smad3信息通路和上调Smad1/5信息通路,从而抑制EMT和ECM的沉积。

3.1.2Wnt/β-catenin信号通路 Wnt是重要的半胱氨酸糖蛋白质,它被细胞分泌到细胞外基质中,并在接触细胞时激活受体介导的信号传递。Wnt信息通道包含典型的Wnt/β-catenin、非典型的Wnt/Ca2+和细胞极性通道,其中以典型的Wnt/β-catenin信息通道最为重要。 Wnt/β-catenin信号能够刺激上皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞表达Snail1、Twist、基质金属蛋白酶-7和血管紧张素等下游介质,它们参与肾纤维化的形成[8]。此外,Wnt/β-catenin信号还能通过与其他信号通路交织在一起,如TGF-β/Smad通路、Notch通路和结缔组织生长因子等,促进肾间质纤维化。越来越多的证据表明,Wnt/β-catenin信息通道在DN的TEC的EMT过程中发挥着关键作用。He等[9]的实验发现,Wnt/β-catenin信息通道能够促进高糖(high glucose,HG)诱导的人近端小管上皮(HK-2)细胞EMT,而当抑制β-catenin的表达时,HK-2细胞EMT被减轻。C-反应蛋白(CRP)被证明可促进TEC的EMT,它是通过活化Wnt/β-catenin这一信号通路来实现的[10]。

3.1.3Notch信号通路 Notch信号通路是一种细胞-细胞通信机制,其通过Notch受体(Notch1-Notch4)的异常激活介导疾病的发生和发展。Notch信号在肾小球上皮细胞中的增多与蛋白尿和肾小球硬化有关,而Notch信号在TEC的增多则与肾间质纤维化密切有关。Cummins等[11]的研究证明,Notch4的过表达可增强人源性肾小管细胞系中TGF-β介导的肾纤维化,并且其在糖尿病小鼠和人的纤维化肾的肾小管中表达增加。Notch通路与DN的发生发展密切相关,并对EMT的诱导起着重要作用。Li等[12]的实验表明,当HG诱导的HK-2细胞中Notch通路成员(Notch1、Jagged-1、Notch细胞内结构域(NICD)、Hes5)水平下降时,波形蛋白和α-SMA的表达同样也降低了,而上皮钙黏素的表达则显著升高。Yang等[13]的研究表明,在DN模型KKAy小鼠中,通过降低Notch1、Jagged-1和Hes1在TEC中的表达水平,可以有效阻止HG诱导EMT发生。

3.1.4其他信号通路 DN中TEC的EMT发生还与TLR4/NF-κB、ERK1/2、JAK/STAT3等信号通路有关。S100A8和S100A9是一类与免疫和炎症反应相关的蛋白质,它们在糖尿病RTEC中表达升高。研究表明,S100A8/A9的过度表达可以活化TLR4/核因子κB(NF-κB)信号通路,促进EMT过程,导致糖尿病小鼠肾间质纤维化的发生[14]。研究表明,抗炎中成药黄葵胶囊可以有效地控制肾脏NLRP3炎症小体的活性,并且可以阻断TLR4/NF-κB信号通道,从而缓解了DN模型大鼠的肾小管EMT进程[15]。ERK1/2信号通路也与肾间质纤维化相关。在链脲佐菌素诱导的DN中,CRP可以通过Wnt/β-catenin和ERK1/2信号通路促进EMT[10]。Gao等[16]在探讨豆蔻素(CAD)在糖尿病大鼠肾损伤中的作用的研究发现,CAD通过抑制大鼠RTEC中的PI3K/AKT和JAK/STAT3信号通路,减弱了RTEC的EMT,从而减轻了糖尿病诱导的肾损伤。

3.2 炎症与EMTDN是一种严重的慢性肾脏疾病,持续的微炎症状态在它的进展中起着核心作用。在DN中,NOD样受体(NLRs)、Toll样受体(TLRs)、NF-κB、JAK/STAT等炎症信号通路上调,细胞粘附分子-1 (ICAM-1)、血管粘附蛋白-1 (VAP-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白介素-1(IL-1)、IL-6、 IL-18等炎症介质大量释放,导致巨噬细胞、树突状细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞等炎症细胞向肾间质浸润。并且所有的这些事件形成正反馈回路,无限放大炎症反应,从而加重肾损害[17]。此外,持续的炎症状态刺激大量间充质细胞转化为肌成纤维细胞,从而导致进行性肾纤维化的发生。S100A8/A9主要由中性粒细胞和单核细胞分泌,在炎症这一极其复杂的事件中发挥着重要作用。已有研究证明,它们可通过激活RTEC中的TLR4/NF-κB信号通路,促进EMT发生[14]。C-X3-C基序配体1(CX3CL1)已被证明参与炎症反应。当CX3CL1的表达升高时,可通过激活RAF/MEK/ERK通路来促进高血糖或HG诱导的肾小管EMT[18]。可见,炎症可通过单一机制或与其它信号通道相互作用,激活TEC的EMT事件。

3.3 氧化应激与EMT肾脏氧化应激通常是由诱导活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生的促氧化酶增多和抗氧化剂耗尽共同引起。在肾脏中涉及许多生成ROS的酶系统,其中NADPH氧化酶是最重要的贡献者。ROS在DN的发病机制中扮演着重要角色。高血糖、高游离脂肪酸会激发NADPH氧化酶,从而生成巨量的ROS,而这部分ROS无法被抗氧化剂消除,从而引起炎症细胞的大规模集聚,进而促进炎症细胞因子、生长因子和转录因子生成,加剧了DN肾纤维化的发生。ROS在DN的EMT过程中起着重要作用。Lu等[19]的研究证明,HG通过增加正常大鼠肾小管上皮细胞系(NRK-52E)内ROS的产生促进TGF -β1的表达,并激活PI3K/Akt信号通路,导致雷帕霉素靶点(mTOR)磷酸化,促进肾小管EMT发生。发育调控和DNA损伤应答1(regulated in development and DNA damage response 1,REDD1)是新发现的缺氧诱导因子-1(HIF-1)的靶基因。Mu等[20]的研究发现,REDD1在DN患者和糖尿病小鼠的肾脏中表达增加,其缺失显著抑制了糖尿病小鼠的凋亡和EMT。该研究进一步通过体外实验表明,HG可诱导内源性REDD1与硫氧还蛋白相互作用蛋白形成强大的复合物,通过抑制ROS的产生来阻止HG诱导的细胞凋亡和EMT。

3.4 自噬与EMT自噬是一种复杂的多步骤过程,它通过溶酶体依赖的机制降解受损蛋白和大分子,以保持细胞内的平衡与稳定。在正常情况下,足细胞具有较高的自噬水平,但如果自噬水平不足,就会增加肾小球疾病的风险。与足细胞不同,RTEC表现出低水平的基础自噬,以防止细胞衰老及缺血再灌注损伤。然而,持续的自噬上调将导致肾纤维化的发生。因此,在正常血糖水平下,自噬是肾脏上皮细胞的重要保护机制。在慢性高血糖的刺激下,自噬调节失常,将促进DN的发生和发展。自噬是一种生物过程,它的启动和自噬体的形成需要许多基因组,目前已经发现了30多个自噬相关基因蛋白,它们在调控自噬流程中起着至关重要的作用。Beclin1、LC3、p62都是与自噬相关的关键蛋白,因此它们常被作为评估自噬的标记物。自噬活性与Beclin1、LC3II的表达水平呈正相关,而与p62的表达水平呈负相关。mTOR和AMP激酶(AMPK)是与自噬启动相关的两个关键分子。mTOR通常负责抑制自噬,而AMPK与mTOR途径的作用相反,是自噬的一种正性调节因子。Wang等[21]在探讨二甲双胍对DN肾纤维化的影响的研究发现,在DN大鼠中,P62表达升高,LC3II/I比值降低,表现为自噬抑制。当使用二甲双胍治疗后,P62表达下降,LC3II/I比值升高,自噬显著增加,肾组织中的纤维连接蛋白和I型胶原蛋白的表达降低。体外研究进一步发现,高血糖状态下,在p-AMPK失活的TEC中,上皮钙黏素的表达水平下降,α-SMA的表达水平升高。Xu等[22]的研究发现,当使用自噬激活剂(雷帕霉素)时,减弱了高糖诱导的HK-2细胞的脂质蓄积和EMT,而使用自噬抑制剂(二磷酸氯喹等)时,则加剧了脂质蓄积和EMT。该研究也发现,持续高糖诱导的自噬激活会导致HK-2细胞表现出EMT。因此,一定水平基础的自噬激活可以抑制EMT的发生,但当自噬持续激活时,将会发生病理变化,发生EMT上调。

3.5 肾素-血管紧张素系统(RAS)与EMTRAS是参与血压和盐平衡调节的激素系统。它的过度激活将会构成一种致病机制,导致组织损伤和纤维化的发生。肾内的血管紧张素肽水平明显高于血浆或其他器官组织,其中,血管紧张素II (AngII)是RAS重要生理功能的主要效应物。在慢性高血糖的刺激下,AngII在肾脏局部升高,通过诱导氧化应激、炎症和一些生长因子及其受体的上调引起蛋白尿,最终导致小管间质纤维化。此外,AngII能显著影响RTEC中α-SMA的表达,并且呈时间依赖性增加,通过诱导EMT促进肾纤维化的发展。这一过程主要通过TGF-β1这一关键介质来介导。Zhou等[23]的研究证明,HG通过使局部RAS升高后激活AT1受体,导致TGF-β1的合成增加,促进ERK1/2磷酸化,诱导RTEC发生EMT。Chen等[24]的研究发现,AngII以时间和剂量依赖的方式显著提高各种Wnt mRNA和活性β-catenin蛋白在HK-2细胞中的表达水平。表明Wnt/β-catenin信号通路也参与AngII介导的EMT过程。

3.6 微RNAs(miRNAs)与EMTmiRNAs是一种小的非编码RNA分子,被发现广泛存在于哺乳动物细胞中,通常含有18～24个核苷酸,可调控人类基因组编码的大多数基因的表达。其除了能调节肾脏发育和维持稳态外,还能驱动包括DN在内的许多肾脏疾病的病理。miRNAs可以通过调节EMT来影响DN的结局。大部分miRNAs通过影响TGF-β信号转导途径来参与DN的EMT过程。Wang等[25]的实验发现,在NRK-52E中,TGF-β1和TGF-β2均可使miR-200a的表达水平降低,从而Smad-3的活性被减弱,导致TGF-β引起的EMT得到减轻。该研究还发现,miR-141和miR-200a均可抑制TGF-β2的表达,从而间接影响TGF-β1的表达水平。因此,miR-200a和miR-141既可作为TGF-β信号的下游介质,也可作为反馈调节介质来影响TGF-β依赖的EMT。Sun等[26]的研究发现,在TGF-β1处理HK-2细胞和糖尿病OLETF大鼠的肾皮质中,miR-133b和miR-199b表达水平显著上升。当它们被抑制后,可有效缓解TGF-β1诱导的HK-2细胞和糖尿病OLETF大鼠的EMT和肾纤维化,这个过程被证明通过激活Sirt1实现。除TGF-β信号通路外,PI3K/AKT通路是miRNAs影响的另一常见通路。有研究证明,下调miR-320c导致PI3K/AKT信息通路被抑制,从而减轻了HG诱导的EMT,同时还减弱了HK-2细胞的迁移力和侵袭力[27]。

3.7 其他机制与EMT锌指DNA/RNA结合转录因子阴阳1(Yin Yang 1,YY1)参与包括DM在内的多种代谢性疾病,并被证明是肾纤维化的一种新型调节因子。Yang等[28]的实验表明,YY1在db/db小鼠及HK-2细胞中表达增加。进一步研究发现,HG通过mTORC1/P70S6K信号通路诱导YY1的过表达和核易位,并上调α-SMA的表达,随后通过EMT相关蛋白失调而促进肾纤维化发生。因此,YY1在TEC的EMT中的重要作用不容忽视。长链非编码RNA(lncRNA)在调节肌成纤维细胞活化和肾纤维化中发挥关键作用,被证明可促进DN肾小管发生EMT。转移相关肺腺癌转录本1 (MALAT1)属于lncRNA家族,因最早在肺腺癌中发现而得名。Zhang等[29]的研究发现,在HG刺激的HK-2细胞中,MALAT1的表达显著增多,并导致TEC发生EMT。进一步研究证明,这个过程是通过激活Wnt/β-catenin通路来触发的。最近的研究发现,补体系统可能也参与了肾小管EMT的发生。V-set免疫球蛋白结构域4 (VSIG4)是补体C3的受体。Gong 等[30]的实验发现VSIG4在高糖刺激的HK-2细胞中上调,并诱导EMT。当VSIG4被抑制时,HG诱导的EMT进程也被抑制。进一步研究表明,VSIG4是TGF-β的下游调节因子,其通过TGF-β信号通路促进肾小管EMT。

4 展望

总之,TEC的EMT在DN肾间质纤维化的发生发展中扮演着重要角色,为治疗DN提供了一种全新的思路。在DN中,TEC发生EMT的发病机理复杂且相互交织。因此,深入探讨EMT的发生机制、调理机制、以及参与其中的信息通路将促进新的治疗策略的发展,为改善DN的预后创造更多的可能性。然而,目前关于TEC的EMT参与DN肾纤维化的研究主要集中在细胞实验和动物实验,未来我们需要在临床患者中进行更多的研究。