葡甘露聚糖凝胶对大鼠混合感染性阴道炎模型的作用研究

高 乔 张润涛 刘 聪 李 佳 节笑笑 倪 艳 康 永▲ 杨黎彬 韩文霞李伟泽

1.山西省中医药研究院，山西太原 030012；2.江苏微纳医药科技有限公司，江苏扬中 212218

阴道炎是阴道发生炎症后导致外阴出现瘙痒、灼痛、异味、刺激和异常分泌物的一类病症，其常见的类型有霉菌性阴道炎、细菌性阴道炎、萎缩性阴道炎（老年性阴道炎）以及滴虫性阴道炎[1]。阴道炎的发生多为阴道加德纳菌（gardnerella vaginalis，GV）为主的厌氧菌增殖状态异常，并伴随阴道微环境中优势杆菌如乳杆菌的减少，从而引起阴道菌群构成发生改变[2]。研究调查资料显示，阴道炎的发生率为20%～60%，该病对女性的日常生活和心理有很大的负面影响，得病后易表现出焦虑、羞愧以及对个人卫生等症状反复出现的担忧[3]。临床上治疗阴道炎多以口服加外用甲硝唑等抗生素为主，外用抗生素类药物在治疗过程中容易引起阴道微生态紊乱的情况[4]。

葡甘露聚糖凝胶[5]（专利号：ZL202010787982.9）是一种由中药积雪草、白及、蛇床子提取物制成，为治疗妇科炎症而正在研制的复方中药新药，具有黏附性高且作用持久的优点，本研究通过建立混合感染性阴道炎模型，来研究该药物治疗阴道炎的效果。

1 材料与方法

1.1 药物及菌株

葡甘露聚糖凝胶[5]（江苏微纳医药科技有限公司提供，批号：20201109）；空白凝胶基质（江苏微纳医药科技有限公司提供，批号：20201109）；复方甲硝唑阴道栓（河北金牛原大药业科技有限公司，批号：09200912）；苯甲酸雌二醇（上海全宇生物科技动物药业有限公司，批号：201203）；氢化可的松（上海上药信谊药厂有限公司，批号：019200301）；金黄色葡萄球菌（北京北纳创联生物技术研究院，批号：21031627）；大肠杆菌（北京北纳创联生物技术研究院，批号：20122915）；白色念珠菌（北京北纳创联生物技术研究院，批号：20120208）。

1.2 动物

健 康SD（sqrague dawley）大 鼠，SFP级，雌性，体重170～190 g，由中国食品药品检定研究院提供，许可证号：SCXK（京）2017-0005，批号：No.111251210100065347。

1.3 试剂

肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）试 剂 盒（Bio-Swamp，批 号：No.202104）；白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA试剂盒（Bio-Swamp，批号：No.202104）；白介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA试剂盒（Bio-Swamp，批号：No.202104）；白介素-8（interleukin-8，IL-8）ELISA试剂盒（Bio-Swamp，批号：No.20215）；表皮生长因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）ELISA试剂盒（Bio-Swamp，批号：No.202104）。

1.4 仪器

C5微孔板检测仪（美国伯腾）；LEICA RM2125石蜡切片机（莱卡上海分公司）；PM.10AD光学显微镜（日本Olympus）；KDC-2046低速冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；KP-XW80旋涡混合仪Vortex（凯普生物科技有限公司）；Microfuge 20R离心机（BECKMAN COULTER）。

1.5 伦理

本研究所用动物及相关处置符合动物伦理的要求，实验开展前已经过本机构动物伦理委员会的伦理审查，伦理审查编号：CIRP-IACUC-（G）2022072。

1.6 方法

1.6.1 动物分组及模型[6]建立 菌株常规培养、传代后，进行菌液的制备，菌液浓度调整至2×108CFU/ml，将三种菌液按1∶1∶1比例进行混合备用。

将70只雌性SD大鼠进行为期一周的适应性喂养，采用随机数表法将70只大鼠分为空白组（10只）和给药组（60只），将给药组大鼠进行混合感染性阴道炎模型的建立。造模大鼠进行皮下注射苯甲酸雌二醇注射液2 mg/kg，2 d/次，连续3次，使大鼠出现假动情期。次日开始每只大鼠皮下注射氢化可的松注射液60 mg/kg，每日1次，连续3 d，复制大鼠免疫功能低下模型。之后将已制备好的金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌菌悬液按照1∶1∶1混合，用1 ml注射器接灌胃针，吸取菌悬液0.2 ml/只注入造模大鼠阴道内，隔日一次，共3次，注入后在阴道口塞入棉球防止菌液流出。第3次感染24 h后，用无菌棉签沾取阴道分泌物分别涂于营养琼脂平皿和沙氏葡萄糖琼脂平皿表面，常规培养24 h后平板上肉眼观察可见大小不等的细菌菌落，即证明感染成功。造模结束后，将造模成功的60只大鼠使用随机数表法分为模型组、复方甲硝唑组、凝胶基质组、葡甘露聚糖凝胶高、中、低剂量组，每组各10只雌鼠。

1.6.2 动物给药 造模结束后开始阴道内灌注给药，复方甲硝唑组给予复方甲硝唑阴道栓0.4 g/kg，葡甘露聚糖凝胶高、中、低剂量组给予1.2、0.6、0.3 g/kg，凝胶基质组给予中剂量同体积量葡甘露聚糖凝胶基质，空白组给予等体积生理盐水，每天1次，连续给药1周。

1.6.3 大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、EGFR含量检测 末次给药结束后，禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛溶液对各组大鼠进行麻醉，腹主动脉取血至EP管中，置于室温放置2 h后，3000 r/min离心20 min，取上清后，制备血清，-20℃保存。ELISA法通过微孔板检测仪测定大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8、EGFR的含量。

1.6.4 大鼠阴道黏膜组织病理学变化 取宫颈组织，立刻置于10%的福尔马林中固定，石蜡包埋，进行横切面切片，HE染色，200、40倍光镜观察宫颈组织病理形态学变化。

1.7 统计学分析

数据使用SPSS 26.0统计学软件计算并分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两分别比较采用LSD-t检验，P＜ 0.05为差异有统计学意义，P＜ 0.01为差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量比较

模型组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8大于空白组大鼠，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01）；给药后，葡甘露聚糖凝胶各剂量组、复方甲硝唑组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8均小于模型组大鼠，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01）；凝胶基质组与模型组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）；葡甘露聚糖凝胶高剂量组与中剂量组血清中TNF-α、IL-6、IL-8小于复方甲硝唑组，差异有统计学意义（P＜ 0.05），见表1。

表1 各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量比较（pg/ml，±s）

表1 各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量比较（pg/ml，±s）

注 与空白组比较，aP＜ 0.01；与模型组比较，bP＜ 0.01；与复方甲硝唑组比较，cP＜ 0.05，dP＜ 0.01；TNF-α：淋巴毒素；IL-1β：白介素-1β；IL-6：白介素-6；IL-8：白介素-8

组别 n 剂量（g/kg） TNF-α IL-1β IL-6 IL-8空白组 10 110.01±6.43 13.89±1.05 33.24±2.99 157.69±16.78模型组 10 169.80±7.50a 65.81±3.70a 84.59±3.64a 256.44±8.59a复方甲硝唑组 10 0.4 136.80±10.44b 39.68±7.32b 55.42±4.18b 198.04±9.10b葡甘露聚糖凝胶10 1.2 125.25±2.44bc 29.59±2.53b 41.31±2.82bd 171.24±5.32bd 10 0.6 128.88±6.58bc 37.16±3.37b 46.60±4.79bc 180.75±16.66bc 10 0.3 140.28±6.87b 50.77±1.84b 60.22±6.42b 199.29±3.22b凝胶基质组 10 161.02±9.83 67.71±2.36 81.31±5.71 246.72±15.78 F值 45.028 166.457 110.654 58.237 P值 0.002 0.003 0.005 0.006

2.2 各组大鼠血清中EGFR含量比较

模型组血清中EGFR含量明显小于空白组大鼠，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01）；给药后，葡甘露聚糖凝胶各剂量组、复方甲硝唑组大鼠血清中EGFR含量均大于模型组大鼠，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01）；凝胶基质组与模型组血清中EGFR含量比较，差异无统计学意义（P＞ 0.05）；葡甘露聚糖凝胶高剂量组及中剂量组血清中EGFR含量大于复方甲硝唑组大鼠，差异有显著统计学意义（P＜ 0.01），见表2。

表2 各组大鼠血清中EGFR含量比较（ng/ml，±s）

表2 各组大鼠血清中EGFR含量比较（ng/ml，±s）

注 与空白组比较，aP ＜ 0.01；与模型组比较，bP＜ 0.01；与复方甲硝唑组比较，dP＜ 0.01；EGFR：表皮生长因子

组别 n 剂量（g/kg） EGFR空白组 10 3.35±0.16模型组 10 1.53±0.08a复方甲硝唑组 10 0.4 2.50±0.19b葡甘露聚糖凝胶 10 1.2 3.01±0.12bd 10 0.6 2.88±0.05bd 10 0.3 2.57±0.07b凝胶基质组 10 1.66±0.15 F值 177.563 P值 0.005

2.3 各组混合感染性阴道炎模型大鼠阴道黏膜组织病理形态学

光镜（40、200倍）下大鼠混合感染性阴道炎模型阴道黏膜组织进行病理形态学检查：空白组阴道被覆鳞状上皮，上皮细胞排列紧密，形态正常，肠腔可见大量坏死细胞碎屑，考虑为阴道上皮周期性变化的产物，非病变所致，固有层胶原丰富，排列紧密，见极少量炎性散在浸润。模型组阴道被覆鳞状上皮，上皮细胞排列紧密，上皮可见少量中性粒细胞，为阴道上皮周期性变化中的正常现象，固有层水肿，结缔组织排列疏松，伴较多炎性细胞散在浸润，与空白组比较，炎症反应明显加重。葡甘露聚糖凝胶高、中剂量组阴道被覆鳞状上皮，上皮细胞排列紧密，上皮可见少量中性粒细胞，为阴道上皮周期性变化中的正常现象，固有层胶原丰富，排列紧密，见极少量炎性散在浸润。见图1～2。

图1 各组混合感染性阴道炎模型大鼠阴道黏膜组织病理形态学（HE染色，200×）

图2 各组大鼠阴道黏膜组织病理形态学（HE染色，40×）

3 讨论

在健康的育龄女性中，典型的阴道微生物区系包括需氧菌群、兼性厌氧菌和专性厌氧菌，大多数女性的阴道微生物群以乳酸菌为主[7]。在很多情况下，阴道感染的局部治疗与口服治疗相比效果相当甚至效果更好，局部给药后药物作用更为直接且浓度更高，药物相互作用更少，副作用更少。此外，微生物对抗生素药物耐药性的出现、控制感染复发的困难以及传统剂型存在阴道滞留率低和不适的问题支持了对更有效的局部治疗的需要[8]。阴道炎是一种阴道黏膜和黏膜下结缔组织的炎症，阴道炎患者的阴道微生物区系以一些需氧细菌为主，如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌[9]。阴道炎可能发展到子宫深部感染，严重者可导致孕妇早产[10]。阴道炎相关的致病细菌已被证明通过树突状细胞成熟诱导免疫激活，并增加促炎细胞因子的水平，从而导致生殖道黏膜炎症[11-12]。在EGFR基因缺失的小鼠中，小鼠伤口表现出异常强烈和弥漫性的炎症细胞浸润，这表明EGFR在慢性炎症性疾病中发挥关键作用[13]。

虽然在临床上常使用抗菌药物治疗，但目前尚无标准的治疗方法[14]。然而，频繁和长时间使用广谱抗生素可能会导致诸多更为严重的不良反应，如阴道菌群失调、继发感染和耐药性[15]。阴道炎属于中医“带下病”范畴，《傅青主女科》曰：“夫带下俱是湿症”，因此带下病的病因以湿邪为主，治法宜清热利湿泄浊[16-20]。葡甘露聚糖凝胶是一种由中药积雪草、白及、蛇床子提取物制成，为治疗妇科炎症而正在进行研制的复方中药新药，其中积雪草清热利湿、解毒消肿，白及收敛止血、消肿生肌，蛇床子燥湿祛风、杀虫止痒，全方共行祛腐生肌，消肿止痛，杀虫止痒的功效[5]。本研究通过使用大肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌建立大鼠混合感染性阴道炎模型，用ELIAS法检测TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8以及EGFR含量的变化，结果显示葡甘露聚糖凝胶可明显降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的含量、升高EGFR的含量，结合病理检测结果，表明葡甘露聚糖凝胶在局部治疗阴道炎后可明显减轻炎症反应，具有良好的治疗效果和临床推广价值。