海藻多肽的提取分离及抗肿瘤活性研究进展

沈金阳,张烜,于媛媛,张世诚,施柳清,董自波,3

(1.江苏海洋大学 药学院,江苏 连云港 222000;2.连云港贵科药业有限公司,江苏 连云港 222000;3.江苏省海洋药用资源开发工程研究中心,江苏 连云港 222001)

地球的大部分面积是海洋,海洋也是生命的起源地.海洋的环境有其独特性,如温度低、光照弱、大气压高、盐度高,而且营养含量低,海洋生物为了适应这种特殊的环境,在其生长和代谢进程中,也产生了许多陆地生物不存在的具有特殊结构和功能活性物质[1].目前,科学家对海洋生物的兴趣日趋浓厚,开始寻找海洋生物中具有抗肿瘤活性的物质,近年来取得了迅猛的发展.在美国国立癌症研究所(national cancer institute,NCI)筛选的新型抗癌化合物中,有相当一部分来源于海洋生物.但其中对多肽的研究相对较少,特别是对海藻多肽[2].而海藻中富含蛋白质等活性物质,从中提取的多肽表现出一定的抗肿瘤活性,其最大的优点为高效、低毒,若对活性肽做适当的优化改造,将其发展为药品的潜力巨大,市场前景广阔[3].本文主要综述海藻多肽的提取纯化和鉴定方法及抗肿瘤活性研究进展,以期为海藻多肽在药品领域的开发应用提供一定的参考.

1 海藻多肽的提取方法

对于生物体内存在的天然多肽,可以利用传统的方法如煎煮法、浸渍法和渗漉法等进行直接提取,但因为提取效率很低,现已少用;除此之外,还有化学提取法、酶解法和微生物发酵法等,这些方法能将蛋白的肽链分解成分子量和长度不同的小肽段,从而利于进一步的分离纯化;而对于一些提取难度大或者无法直接提取的多肽,可以利用合成技术对氨基酸的结构进行改造,获取到需要的多肽[4].

1.1 化学提取法

化学提取法是指采用某些化学试剂对肽键进行水解,提取得到多肽的方法,多采用强酸或强碱溶液,也有研究用到甲醇或卤代烃等试剂,因为价格低,易操作,过去广泛应用于多肽的提取.然而,该技术也存在一些缺陷,如工艺控制困难、很难得到期望的如具有某些特定化学成分和功能特性的产品,同时化学试剂往往会改变蛋白质结构,影响其有效性和安全性[5].酸水解是一种重要的化学修饰方法,能显著改变多肽的结构和功能性质[6],最常用的稀酸是硫酸,其次是硝酸、盐酸、磷酸.而碱水解常在27～54 ℃的低温环境下使用碱金属盐对蛋白质进行水解,多用到氢氧化钙、氢氧化钠或氢氧化钾等,其缺点是往往会破坏丝氨酸和苏氨酸,从而导致产品功能性差,而且部分产物还有致癌性[7].

林彬彬等[8]采用以氢氧化钠为主的碱溶液提取龙须菜蛋白质,优化碱提工艺,在最佳条件下,蛋白提取率可达88.48%,后经研究有一定的抗氧化性.林红卫等[9]用十二烷基苯磺酸钠处理钝顶螺旋藻,滤液用硫酸铵盐析,能得到具有抑制癌细胞作用的藻蓝蛋白,其蛋白提取率非常高,接近98%. Foster等[10]使用甲醇对念珠藻反复提取后,多肽提取率得到了明显提高,表现出强烈抑制肿瘤细胞存活的作用.

1.2 酶解法

酶解法是利用一种或多种酶复合方式对蛋白质进行酶解并释放出活性肽的方法.来源于植物的常用酶为木瓜蛋白酶,来源于动物的有胃蛋白酶、胰蛋白酶等,以及商业性质的中性蛋白酶、碱性蛋白酶等.因为酶的专一性,每一种酶的作用位点都不同,则水解后多肽的长度和序列也不同,活性自然也就不同,所以当需要制备活性肽时,尽量先对蛋白酶进行筛选再进行酶解[11].

近年来,有研究显示在消化道发生酶促作用后,蛋白质被酶水解成小分子的肽后更易被人体吸收且速度更快[12].酶解法具有反应过程温和、特异性强、酶解过程易于控制、不破坏氨基酸的结构和性质等特点,但是会产生少量苦味肽,酶解条件要求苛刻,为使得到的活性肽具有更高的活性和产量,需要控制好酶的用量、pH、温度和酶解时间等因素[13].

谢雪琼等[14]采用2步酶解法对坛紫菜藻红蛋白(R-phycoerythrin, R-PE)进行提取纯化,得到1种有药用价值的多肽.第1步为胃蛋白酶与R-PE质量比1∶200,酶解30 min,pH 1.2,温度37 ℃;第2步为胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等量混合,混合酶与R-PE质量比1∶400,酶解时间、温度与第1步相同,pH为7.5,用凝胶电泳分析,2次酶解之后,R-PE被完全降解,再利用R-PE水解液制备出脯氨酰内肽酶(prolyl endopeptidase,PEP)抑制肽,能可逆的非竞争性抑制PEP,而PEP参与人体多种生理功能调节.谈森焱等[15]酶解小球藻蛋白时用到的是复合酶(纤维素酶和果胶酶质量比1∶8),当pH 4.0,温度55 ℃,用时5 h,此时提取条件最佳,提取得到的蛋白质含量占小球藻干质量的14.57%,而在未使用酶时结果仅为11.03%,可见使用酶后提取效率得到了提高.Sheih等[16]用包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶等在内的复合酶对小球藻属微藻提取后的废液进行酶解,得到一种具有11个氨基酸的稳定多肽,这种多肽不仅具备抗高血压活性,还有助于血液循环,能保持机体水分及离子浓度的稳定.蔡思学等[17]采用纤维素酶提取红毛藻藻红蛋白,优化提取条件,当加入纤维素酶与底物质量比为1∶40,温度和提取时间最适宜时,提取的R-藻红蛋白质量浓度为43.64 mg/mL. Zheng等[18]用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶对马尾藻进行提取,对酶解液进行葡聚糖凝胶G-15和反相高效液相色谱分离纯化,得到序列为RWDISQPY的多肽,其IC50为72.24 μmol/L,具有抗高血压活性.

1.3 微生物发酵法

微生物发酵法比较新颖,是指海藻中的蛋白质被微生物发酵代谢产生的酶分解成活性多肽的过程,目前该方法局限性较为明显,微生物菌种大规模纯化和发酵液的纯化技术限制了其工业化生产[19].发酵法的优势在于成本较低、产量高、无污染、很少损失营养等,但发酵条件和水解程度不易控制,产物复杂而且后续分离纯化困难,限制了这种技术的应用.而微生物发酵法是在酶解法的基础上延伸而来,与酶解法相比较,省略了蛋白酶的筛选这一步骤,但需对菌株进行筛选,同时由于发酵液组分相对较复杂,发酵过程用时更久.

目前这种技术在提取海藻多肽的应用较少.张明洞[20]发明了一种利用细菌提取螺旋藻活性肽的专利,而且枯草芽孢杆菌(菌种编号1.1086)廉价易得.结果显示,当小于7%的含水量时制备的活性肽最多,约占螺旋藻干质量的15%～40%,这种多肽对高血压有一定的防治作用,且活性较强.付云[21]同样采用枯草芽孢杆菌YA215发酵螺旋藻渣,对产物使用Sephadex LH-20凝胶层析和RP-HPLC分离纯化,并用MALDI-TOF-MS鉴定这种多肽,经验证该多肽具有抗菌活性,特别对金葡菌活性很强.

1.4 超声波法

超声波法是把声能转换为机械能的方法,在声波的作用下海藻的细胞壁破裂,细胞里的蛋白质流出,由于超声波频率超过20 kHz,所以具有频率大、波长小、穿透力强等特点,故用时短,效率高.余佳[22]以葛仙米为研究对象,对比了化学提取法、冻融法、溶胀法、超声波法以及组织捣碎法等方式,最终发现超声法藻胆蛋白提取率最高,当葛仙米粒径75～125 μm、超声功率700 W,液料比58∶1、温度42 ℃、提取6 h时,提取率达到最大为26.13%,经后续纯化,得到高纯度的藻红蛋白和藻蓝蛋白.孔祥佳等[23]通过实验优化了超声波法的条件,在使用酶解法之后联合使用超声波法,提取坛紫菜中的藻红蛋白,当pH、固液比、加酶量、超声时间、功率在最优条件下提取得到的多肽,提取率较仅使用纤维素酶有了大幅提高,同时,在纤维素酶的作用下,超声波可大幅减少提取时间,可见超声波明显提高提取效率.

1.5 冻融法

冻融法是指在达到一定低温条件下,细胞会发生溶胀从而导致胞内物质流出的一种辅助提取方法,可以反复使用冻融法提取蛋白质,这种方法在国内外都较常使用[24].虽然这种方式操作简单,提取率高,但用时过久[25].赵冰冰等[26]研究了巢湖水华新鲜蓝藻在不同冻融环境下对藻蓝蛋白提取的影响,选择最优冻融条件,经实验,当磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline,PBS)浓度为0.002 5 mol/L,含水量在97%左右时,藻蓝蛋白的提取率和纯度最高,而且仅需冻融1次即可.徐远超等[27]将紫球藻研磨成藻粉,冻融法能最大程度地将藻红蛋白提取出来,藻红蛋白质量浓度能达到36 mg/L,大大高于其他化学或物理提取方法.

2 海藻多肽的分离纯化方法

2.1 膜分离法

膜分离技术在多肽的提取中应用广泛,是一种受外界压力作用下实现分离大小不同分子的技术[28].膜分离技术易操作,能随时控制反应,而且既能实现分离纯化又能实现精制,分离过程不发生相变,没有毒性且不污染环境,基本不影响被分离物的活性.因此,膜分离技术在对氨基酸、多肽及蛋白质等物质的初步分离中使用较多[29].膜分离法主要分为微滤(MF)、超滤(UF)、纳滤(NF)和反渗透(RO)等,由分子大小决定能否通过该滤膜[30].

王晓琴等[31]用木瓜蛋白酶对小球藻蛋白进行提取,用超滤的方法对酶解液进行分离纯化,截留得到分子大小不同的3种组分,并进一步分离纯化,得到纯度较高的小球藻蛋白.之后均以1 mg/mL的剂量进行活性检测,结果显示3种酶解液对HepG2细胞增殖均具有抑制作用,但强度不同,其中平均分子质量3 000～5 000 u对HepG2细胞增殖的抑制能力最强.白露等[32]使用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶的混合物对提取的坛紫菜粗蛋白进行酶解,并超滤,共得到11种大小不同的组分,结果表明：平均分子质量大于10 000 u组分对HepG2和SGC-7901的抑制率接近100%,平均分子质量小于3 000 u组分对MCF-7、HepG2和HT-29的抑制率接近100%,其表现出很好的抗肿瘤活性,特别是肝癌和乳腺癌.陈丽莎等[33]利用一定比例的蛋白酶和食品级海藻酸钠的混合物对海藻进行水解后,对水解液经过处理并初滤后得到提取液,然后再通过分子质量为1 200 u和500 u的纳滤膜进行纯化后浓缩,制得纯度较高的多肽浓缩液.

2.2 色谱法

色谱法的原理是分配系数的不同.色谱法不仅分离迅速,而且反应过程稳定平和,能在同一时间分析多种组分,广受青睐,在海藻多肽分离纯化中应用较多的技术包括离子交换色谱(IEC)、凝胶色谱(SEC)、反相高效液相色谱(RP-HPLC)、毛细管电色谱(CGC)、毛细管电泳(CE)等.

Strantmann等[34]用葡聚糖凝胶LH20层析柱及反相高效液相色谱对蓝藻中的多肽进行分离纯化,得到hapalosin多肽,这种多肽作用于KB和LoVo细胞,对人体的鼻咽癌和结直肠癌显示出细胞毒性作用.Edwards等[35]用二氯甲烷/甲醇(体积比为2∶1)对鞘丝藻进行提取,用真空液相色谱(VLC)进行分离,得到Jamaicamides A-C,这些多肽对人的肺癌细胞H-460和神经-2A小鼠神经母细胞瘤细胞株具有抑制增殖的效果.杨超凡[36]用4-吗啉乙磺酸(MES)溶液对红胞藻进行提取,并辅助使用冻融法,反复冻融4次,采用硫酸铵沉淀法进行沉淀,最后利用葡聚糖凝胶色谱Sephadex G-100进行蛋白纯化,藻红蛋白PE545比文献已报道的纯度进一步得到提升;用机械剪切的方法对条斑紫菜的叶状体进行破碎,用磷酸盐缓冲液反复冻融4次,用硫酸铵沉淀得粗蛋白,接着与苯基琼脂糖凝胶色谱层析联用,并挂柱和洗脱,获得较高纯度R-PE,进一步离心,得高纯度条斑紫菜R-PE.

2.3 多种方法联用

运用多种纯化方法联用,往往能提高分离纯化的效果. GARCLA等[37]用食品级木瓜蛋白酶对绿藻石莼(Ulva lactuca)蛋白质酶解,得到的酶解产物,使用分子量截止过滤色谱与反相高效液相色谱纯化富集,该实验获得的活性肽对血管紧张素转化酶1(ACE-Ⅰ)有抑制作用.王竹君等[29]以碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶对螺旋藻进行双酶解提取后,超滤得到分子质量大于10 000 u、5 000～10 000 u、3 000～5 000 u和小于3 000 u的4种组分,该实验选取了小于3 000 u的进行凝胶色谱分离,共得到6个组分D1-D6,对肝癌、胃癌、结肠癌的5种肿瘤细胞Hep G-2、SGC-7901、A549、MCF-7、HT-29显示出程度不一的抑制作用. 朱林清等[38]以聚球藻PCC7002 为原料,将藻粉溶于氯化钠溶液中,并在80 MPa高压下均质7 min,得到较高浓度的藻蓝蛋白,再经壳聚糖絮凝和硫酸铵盐析后,得到更高浓度的藻蓝蛋白.王天石等[39]在钝顶螺旋藻泥中加入氯化钙溶液,反复冻融2～3次,离心后,进行透析、过羟基磷灰石层析柱,得到较高纯度藻蓝蛋白.冯学珍等[40]采取超滤、凝胶过滤柱层析和反相高效液相色谱对已蛋白酶解的裙带菜产物进行纯化,该多肽具备很高的抑制ACE活性,其IC50为(71.88±1.43) μmol/L.还有学者运用超滤、分子筛色谱、离子交换色谱和质谱分析,从胃蛋白酶消化的条斑藻水解物中制备了一种新型的高纯度抗菌肽[41].

3 多肽的鉴定

多肽的鉴定有质谱分析(MS)、核磁共振(NMR)以及氨基酸序列分析(AASA)等手段,但多采用以MS为基础的相关技术.MS是指选择具有一定质量的离子,与分子之间相互碰撞,得到产物离子,再通过二次质谱分析后,对其进一步整理得到结果[42],同时结合现代计算机技术即可灵敏快速的分析蛋白质组学.

西班牙学者Raquel Pérez-Míguez等[43]开发了一种多肽分离和结构鉴定的方法,用于从3种可食用大型藻类Saccharinalatissima(褐藻)、Codiumspp(绿藻)和Mastocarpusstellatus(红藻)分离和鉴定蛋白质水解物中的肽.首先进行水溶性和碱性可溶性蛋白的提取,然后通过RP-HPLC-QTOF/MS和从头进行分析测序工具来分离和鉴定不同的短链肽.在这3种大型藻类的水解蛋白提取物中鉴定出37种肽,再根据BIOPEP数据库进行检查后,在较长的肽中发现了一些具有潜在抗菌活性肽,丰富了海藻肽的研究内容.李琦等[44]通过凝胶分离、Nano-LC-MS/MS等分离分析手段对海带的多肽进行分析鉴定,得到的多肽短肽DPL、PDPL、GSPDPL进行固相合成,研究发现这些多肽均有潜在降血糖活性.邓真真等[45]利用LC-MS/MS技术对用胰蛋白酶酶解的龙须菜多肽进行了鉴定,使用Q-Exactive质谱仪和Thermo Scientific EASY-n LC 1000系统对分子质量小于等于3 000 u组分中的多肽序列进行鉴定,将MS/MS质谱数据与龙须菜转录组数据集进行比对,确定多肽序列.蔡苗苗[24]等为鉴定GLAP 的氨基酸组成和序列,采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)进行分析,并利用Mascot搜库后比对汇总,对舌状蜈蚣藻提取纯化的抗氧化肽进行结构鉴定. 褚宁宁等[46]用超滤法对钝顶螺旋藻游离肽进行纯化,利用NanoUPLC-MS/MS和数据库进行分析,确定了结构,为螺旋藻的开发提供了参考.

4 海藻多肽抗肿瘤作用机制

生物活性肽(bioactive peptides,BP)由于其氨基酸的组成和排列顺序不同而显示出不同的生物活性[47].大量研究证明海藻来源的多肽具有抗肿瘤活性,其作用机制表现在多个方面[48,49].多肽类药物很可能会成为治疗肿瘤最安全、毒性最小的治疗方法,因为与传统的化疗药相比,多肽具有体积小、对组织具有良好的穿透性、毒性低以及对靶点特异性高的特点,所以其最大优势就是高效、低毒[50].

4.1 直接抑制肿瘤细胞增殖

针对某些肿瘤细胞,BP可以阻碍信号转导或使细胞周期终止,对细胞的增殖产生影响[51-52].王竹君等[29]利用多种酶采用单一或组合酶解法对螺旋藻进行提取获得多肽,分离纯化得大小不一的多种组分,在体内体外实验中抗肿瘤肽D1对移植瘤细胞显示出直接抑制肿瘤细胞增殖的活性,比分离出的其他组分作用都要强. Foster等[10]从念珠藻(Nostocsp.)中提取得Cryptophycins多肽,当紧密结合微管蛋白后可阻断多种肿瘤细胞的有丝分裂,特别是 Cryptophycins1和半合成的Cryptophycins8能抑制肿瘤细胞组装成微管,影响增殖,对多种移植瘤抑制作用显著.白德发等[53]从海藻乳状丝节藻中分离得到新的有抗肿瘤活性的环五肽化合物Galaxamide 1,对人肝癌、乳腺癌、宫颈癌细胞均显示出较好活性,对癌细胞产生细胞毒性,既能促进细胞早凋又能抑制细胞增殖.韩晶晶等[54]研究发现,C-藻蓝蛋白(C- phycocyanin,C-PC)对HeLa细胞的增殖具有抑制作用,且抑制强度与浓度成正比,该作用与抑制TGF-β1有关,为宫颈癌的治疗提供新思路.

4.2 诱导肿瘤细胞凋亡

细胞凋亡是细胞的正常生命活动,诱导肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的一条重要思路.其中Bcl-2是1种重要的细胞凋亡调控蛋白,Bcl-2家族可分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白2类[55].Mao等[56]发现1种能下调XIAP蛋白作用的蛋白Smac,这种蛋白也存在于海藻体内,可促进肿瘤细胞凋亡. Simmons等[57]在巨大鞘丝藻中找到了具有抗肿瘤效果的环状和线状的多肽,其能破坏细胞微丝网络,破坏肿瘤细胞骨架促使细胞凋亡,同时由于其选择性强,主要针对HCT-116人结肠癌细胞系有效. Wrasidlo等[58]从海洋蓝藻巨大鞘丝藻中提取的脂肽Somocystinamide A (Sc A),能通过活化caspascs-8及其下游因子抑制血管生成和肿瘤细胞增殖,触发肿瘤细胞凋亡.

4.3 提高机体免疫功能

肿瘤的发生跟免疫系统密切相关.在肿瘤患者体内,肿瘤细胞与免疫系统两者相互制约,一方出现问题后两者会相互作用造成恶性循环[59].因此,提高免疫力对治疗肿瘤有积极意义.郝玮等[60]用螺旋藻提取出藻蓝蛋白,通过小鼠实验发现,小鼠的抑瘤率与藻蓝蛋白的浓度和免疫功能成正比,说明藻蓝蛋白能恢复和提高小鼠的免疫网络功能,从而起到杀灭肿瘤细胞的作用.李冰等[61]将藻蓝蛋白液经局部皮下注射到荷瘤小鼠HeLa细胞当中,同时给予氦氖激光照射,结果激光能使自然杀伤细胞的活性及淋巴T细胞的增殖活性同时增强,说明激光对肿瘤死亡信号的传递有促进作用,并使抗肿瘤免疫力得到提高,较单独使用藻蓝蛋白的效果明显增强.齐宏涛等[62]用重组藻红蛋白(R-PE)干预H22荷瘤小鼠,结果能增强抗氧化功能,调节炎性因子的水平,提高肠道occludin和ZO-1蛋白的表达,增强免疫能力,保护肠道屏障,与抗肿瘤作用密切相关.韩敏敏等[63]用藻蓝蛋白联合光动力学疗法,增强脾脏的免疫功能,体液免疫功能得到加强,可见这种抗肿瘤的方法与调节免疫功能有关.

5 展望

目前,抗癌药很大一部分来自天然产物.同时海洋占据了地球表面大部,而海藻又是海洋生物中的重要组成部分,海藻活性肽可被认为是抗癌药物的一个潜在的巨大资源.目前对海藻多肽的研究大多处于起步阶段,同时由于海藻多肽的分离纯化存在一定的困难,所以海藻多肽仍有很大的发展空间,需要进一步发掘海藻资源,寻找更多有应用价值的海藻.由于海藻多肽对肿瘤细胞选择性强,其提取物或者对提取物适当的改造后,有很大的可能性会发展成为肿瘤的预防和治疗药物.随着现代技术和技术联用的发展,将进一步丰富海藻多肽的提取纯化的方法,提高提取纯化效率,获得高纯度的海藻多肽.随着科学家对海藻多肽抗肿瘤作用机制探索的深入,会为海藻多肽治疗肿瘤提供更肯定的证据,希望将来海藻多肽能得到更广泛的应用,为肿瘤的防治做出更大的贡献.