外源激素对枣果环磷酸腺苷和抗坏血酸含量的影响

李双双，潘忠成,2*，张心心，郑鹏飞，田利明，周 柳，张鹏飞，李蒲民

(1.陕西麦可罗生物科技有限公司，陕西 渭南 714200，2.哈尔滨工程大学材料科学与化学工程学院/教育部超轻材料与表面技术重点实验室，哈尔滨 150001,3.山西农业大学园艺学院，山西 太古 030801)

近年来，越来越多的人们开始关注饮食营养和保健作用，药食同源的红枣被人们愈加关注[1]。枣原产于我国，至少有3000多年的栽培历史，且我国是世界上枣产量最大的国家[2-3]。红枣含有丰富的cAMP、VC、多酚类、黄酮类以及多糖类等功能成分，同时又为补中益气、养血安神、缓和药性的常用中药，是集营养与医疗保健于一体的优质滋补品[4]。

1.1 cAMP研究进展

环磷酸腺苷(Adenosine3'，5'-cyclicmonophosphate，简称cAMP)化学式为C10H12N5O6P，在成熟枣果肉中含量为一般动植物的数千至数万倍，是枣果中最重要的生物活性物质[5]。它是蛋白激酶致活剂，是最重要的胞内信使之一，能参与细胞分裂与分化、形态建成、类固醇生成、糖原和脂肪分解等多种生理生化过程，在基因表达中发挥至关重要的作用，能抑制细胞增殖、癌细胞、过敏性疾病等，对神经系统也有调节作用，还能诱导激素或酶的合成，促进机体合成代谢[6-8]。还有研究表明，包括癌症、高血压、冠心病、心肌梗塞在内的40余种疾病均与人体内cAMP代谢相关[9-10]。

1957年Sutherland[11-12]从哺乳动物的组织中发现了cAMP。刘孟军和王永蕙[13]对枣和酸枣等14种植物的cAMP进行了研究，测定结果表明，枣和酸枣含量明显高于其他植物，并且山西木枣成熟果肉中含量最高。由于大枣中cAMP含量丰富，近年来从枣中提取cAMP的相关的研究较多。JCyong等[14]率先从枣中分离出cAMP，利用离子交换柱法并优化了该分离提取工艺。环磷酸腺苷的测定方法有高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC)、竞争蛋白法、薄层层析、酶联免疫法等方法。目前，HPLC已成为cAMP测定的常用方法[15]，HPLC以其分离、定量分析性能高，分析速度快、操作简便、检测灵敏、适用范围广等优点，逐步在分析领域内占据重要的地位[16]。

张明娟等[17]采用高效液相色谱法测定了8种枣果中的cAMP的含量，其中最高的为朝阳圆枣(375.61μg/g)，最低为1-早脆王(46.01μg/g)，由该试验可知超声时间、乙醇浓度、料液比对cAMP的提取有不同的影响，各因素作用主次顺序为：料液比>超声时间>乙醇浓度，料液比1：25。赵堂等[18]以宁夏几种特色红枣(灵武长枣、同心圆枣和中宁圆枣)为研究对象，并与山东大枣、陕北滩枣进行比较，结果发现宁夏的灵武长枣(335.71μg/g)含量最高，灵武长枣以其个大、味甜等享誉国内外。通过本研究可发现，灵武长枣在药用价值方面也具有一定的竞争优势，研究结果为进一步推动灵武长枣走向国际市场提供了一定的科技支撑。

也有学者研究过不同处理措施对枣中环磷酸腺苷含量的变化影响。刘世军等[19]研究发现，经与未经炮制的大枣生品比较中，经过炮制的大枣中环磷酸腺苷含量均有提高，其中经过醋蒸的大枣环磷酸腺苷含量增加最为明显。张冠楠等[20]以灵武长枣为试材，采用海藻酸钠、壳聚糖、普鲁兰多糖进行涂膜处理。研究表明，各处理果中环磷酸腺苷含量均远远高于对照组，其中，壳聚糖涂膜处理环磷酸腺苷含量提高最为显著。

1.2 VC研究进展

抗坏血酸(easorbiceaidAsA，VC)主要存在于日常食用的新鲜蔬菜水果中，它作为人体必不可少的一种维生素，可以帮助人体内铁的吸收，降低人体血液胆固醇浓度，预防普通感冒，促进蛋白质的牢聚性，防治环血病等，从而起到延长寿命的效果[21]。重要的是它可以参与到人体的某些代谢活动中，对生物氧化有重要影响，增强机体的抗病力和解毒作用等。在化学实验中也可作为还原剂、掩蔽剂及色谱分析试剂等[22]。

VC是植物中广泛存在的一种水溶性抗氧化有机小分子，1932年Wang和King[23]首先分离出纯的VC，并证明是抗坏血病因子。植物抗坏血酸首先在线粒体内膜上合成，然后再运输到胞内其他亚细胞区室和质外体中。由于调节性转运体系的存在，抗坏血酸能够根据生理、发育和代谢的需要在不同细胞区间迅速转移，因此植物不同组织抗坏血酸含量存在差异[24]。在VC含量测定中，HPLC法相较于滴定法，荧光法优势在于稳定性好重复性高，已有部分研究者侧重使用[25-26]。

李小梅等[27]对野生酸枣果肉、酸枣仁、红心猕猴桃和冬枣中维生素C含量进行测定和比较。研究表明，野生酸枣果肉中维生素C的含量最高，达到436.65mg/100 g，是红心猕猴桃的3.6倍，冬枣的1.5倍，酸枣仁中维生素C的含量最低，仅有16.353mg/100 g。石东里等[28]对滨州市21个枣品种的VC含量进行了测定，发现一般鲜枣果实的抗坏血酸含量都在200mg/100 g以上，大部分在300mg/100 g～500mg/100 g之间，平均为418mg/100g，其中在500mg/100 g以上的品种有酸枣、金丝小枣、阳信大枣、长红和滨北薄枣。

国内外研究者为提高VC含量，做了大量研究。孙学成等[29]采用分期播种的方法研究了钼对冬小麦叶片中VC含量的影响，结果表明施钼提高了冬小麦叶片中VC含量，在取样温度较低时，VC含量上升幅度大。

1.3 外源激素：植物生长调节剂

植物生长调节剂是经过果实表皮、叶片的角质膜等进入果树体内来调节果树不同时期的生长发育状况，由于它吸收好、用量小、作用大以及高效等优点，在农业生产中广泛被使用[30]。我国使用频繁的属生长素与GA类的化合物，多应用于果蔬、棉花等作物来提高产量。其中GA经常被用来促进植物芽和叶的伸长与生长；ABA是一种抑制高等植物生长的植物激素，多用于提高花卉园艺的应用价值。α-萘乙酸及其钠盐等类均具有一定的生长素的活性，它能促进根的伸长和不定根的形成，以及果实、块根和块茎的膨大，在栽培时常被用作膨大素来使用，且经过田间试验证明了它能提高苹果、梨、葡萄、弥猴桃等果树以及辣椒、茄子等蔬菜单果重，并大幅度提高产量，改善品质。

果实的功能营养随着人们生活水平的提高愈加得到关注，同时能够提高果实营养价值的植物生长调节剂的使用也成为农业上必不可少的栽培技术之一，此技术也很好的为枣农收益做出了贡献。基于此，本试验选定了植物生长调节剂对不同生长期的枣进行处理，来比较分析调节剂对果实cAMP、VC等功能物质的动态影响，为枣果实提高功能物质技术的研究提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 试验点 试验地点在山西省太谷县，壶瓶枣枣树属小冠疏层形。

2.1.2 试验设计 在枣幼果期进行处理。试验分为赤霉素(GA)、α-萘乙酸钠、脱落酸(ABA)以及清水对照组(CK)。选择长势一致并良好的枣树，完全随机区组设计，每处理分为5个重复，每小区2株。

2.2 试验方法

2.2.1 喷施处理及采样 试验中所选用的植物生长调节剂为GA、ABA和α-萘乙酸钠。在枣幼果期进行喷施，共喷施6次。每次均在喷药前进行采样共7次。采样在果树东南西北四个方向进行，适量即可，要求果实饱满、完好，成熟度一致。

2.2.2 测定方法

2.2.2.1 cAMP测定方法

采用HPLC法进行测定。具体步骤如下，液氮研磨，精确称取1.00 g枣样到10mL离心管中，加入7mL 16%的乙醇，震荡，黑暗条件超声提取10min，离心10000转10min，吸取上清液至2mL离心管里，用小离心机离心12000转5min，离完，用移液枪取≥600 μL于小棕色瓶中，过滤膜到小棕瓶，待上样。

色谱条件：赛默飞高效液相色谱仪C18色谱柱；检测波长：260 nm；流动相：甲醇：磷酸二氢钾=2：8(体积比)；流速：1mL/min；柱温：35℃；时长：10min。根据利用抗坏血酸标准品反应所得的标准曲线方程Y= 7.9175X- 0.1926(R2= 0.9997)计算cAMP的含量。

2.2.2.2 Vc测定方法

采用HPLC法进行测定。液氮研磨，准确称取0.1 g样品，加入4mL 0.1%草酸，避光超声提取10min，10000转离心10min，取上清液至10mL离心管中，重复提取1次，合并2次上清液，离心10min，取上清液于2ml离心管，离心12000转5min，用移液枪取≥600 μL于小棕色瓶中，待上样。

色谱条件：赛默飞高效液相色谱仪C18色谱柱；检测波长：240 nm；流动相：0.1%草酸；流速：1mL/min；柱温：35℃；时长：8min。

其中并根据利用抗坏血酸标准品反应所得的标准曲线方程Y= 0.0675X- 0.3664(R2= 0.9765)计算VC的含量。

2.3 数据处理

试验中所有数据均使用Excel进行记录，SPSS 21.0软件进行显著性分析。

3 结果与分析

3.1 外源激素对cAMP的影响

果实cAMP的含量总体上呈现先上升后下降的趋势(图1)。方差分析表明：在幼果期进行了1次施药处理，表现为GA、ABA和α-萘乙酸钠处理的果实cAMP的含量与CK相比差异均不显著。在白熟期8月10日至8月20日，ABA处理的果实cAMP的含量与其他处理相比有显著差异，白熟期8月30日，ABA处理的果实cAMP的含量显著高于CK和GA处理的。脆熟期9月10日，ABA处理极显著高于GA处理，显著高于α-萘乙酸钠处理，同时其他处理均显著高于GA处理。完熟期无显著性差异。其中7月30日至9月10日，GA处理的果实cAMP的含量在生长过程中一直处于缓慢上升的阶段，而脆熟期9月10日极显著低于其他处理。

图1 cAMP标品出峰图

图1 不同处理对壶瓶枣cAMP含量的影响注：数据为平均数±标准误，小写英文字母表示0.05水平差异显著性。下同。

3.2 外源激素VC的影响

果实VC含量动态变化如图2所示。果实可溶性总糖的含量总体上呈现先下降后上升的趋势。枣果在幼果期7月21日各处理的VC含量均达到最大值，分别为1661mg/100g、1564mg/100g、1648mg/100g和1587mg/100g。在白熟期8月10日，ABA处理的果实VC含量显著高于CK处理的。其他时期各处理的果实VC含量无显著性差异。

图2 Vc标品出峰图

图4 不同处理对壶瓶枣VC含量的影响

4 讨论

本试验在壶瓶枣幼果期开始进行喷施GA、ABA、α-萘乙酸钠的栽培技术处理，并对壶瓶枣果实功能成分含量的动态变化进行分析发现，喷施GA、ABA、α-萘乙酸钠对壶瓶枣成熟期果实cAMP、VC含量会有不同程度的影响。

本试验研究结果表明，果实cAMP的含量在果实的生长发育过程中呈现前期积累在完熟期到达最大值后又略微下降的趋势。枣果中的cAMP参与并调节枣细胞的生理活动以及新陈代谢，发挥着重要调节和控制作用。白熟期8月10日、8月20日ABA处理的果实cAMP的含量均显著高于CK、GA和α-萘乙酸钠处理，不同时期分别高出77.19%、48.47%、55.62% 和72.15%、42.27%、101.98%。白熟期8月30日，ABA处理的果实cAMP的含量显著高于CK和GA处理，分别高出2.07倍和0.79倍。脆熟期9月10日，ABA处理极显著高于GA处理，高了8.06倍，且显著高于α-萘乙酸钠处理，为53.99%。其中脆熟期9月10日GA处理的果实cAMP的含量极显著低于其他处理，可能是由于GA处理造成枣果cAMP的合成减缓，使其含量过低造成的。试验研究发现ABA处理对cAMP的含量存在一定的促进作用。

植物体VC的含量受到品种、类别以及栽培技术和环境条件影响之外，还会受到外界因子如光强或昼夜温差变化、气候环境、水肥管理等的影响。本试验通过喷施外源激素观察VC含量变化，研究结果表明，枣果实VC的含量早期最高，后随着果实的发育VC含量逐渐下降，在完熟期有略微的上升。这与大多数的研究结果相似，都支持VC在果实不成熟期的绿色期发生迅速积累，但早期的枣果果肉呈现绿色，质地较疏松，汁少，酸涩，不适宜食用。白熟期8月10日，ABA处理的果实VC含量显著高于CK处理的，高出19.61%。这与Jiang等[31]和Liu等[32]研究结果一致，Jiang等[31]和Liu等[32]研究发现在干旱胁迫条件下，ABA对抗坏血酸含量的影响中均表明，ABA显著提高干旱胁迫下玉米幼苗和白皮松低温胁迫中的VC含量。完熟期CK、GA、ABA和α-萘乙酸钠处理的果实VC含量平均值分别为611mg/100g、642mg/100g、618mg/100g和601mg/100g，此阶段是壶瓶枣最适合食用的阶段，其VC含量比其他瓜果蔬菜的VC高出几十倍甚至更多。本试验ABA处理以及与其他研究者相同的ABA处理，对果实中VC含量均表现为促进作用。

5 结论

(1)ABA处理对完熟前期枣果实cAMP的含量有促进作用。此外白熟期ABA处理的果实cAMP的含量显著高于其他处理。脆熟期ABA处理极显著高于GA处理，显著高于α-萘乙酸钠处理，同时其他处理均显著高于GA处理。完熟期无显著性差异。

(2)ABA处理能有效增加枣果VC含量利于鲜枣提高营养。幼果期各处理的VC含量均达到最大值，此时枣果酸涩汁少不利于食用。白熟期ABA处理的果实VC含量显著高于CK处理的。其他时期各处理的果实VC含量无显著性差异。