美洲大蠊提取物CⅡ-3 调控p53 蛋白抑制K562 细胞增殖

2023-03-10 02:27何思悦唐紫云张成桂毕子莹
大理大学学报 2023年2期
关键词:美洲抑制率细胞周期

何思悦,唐紫云,刘 衡,张成桂,周 雯,毕子莹,周 玥*

(1.大理大学基础医学院,云南大理 671000;2.大理大学药学院,云南大理 671000)

慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)是一种恶性骨髓增生性肿瘤,占成人白血病发病率的15%。目前酪氨酸激酶抑制剂是靶向治疗的主要方式,但治疗过程中易出现多种不良反应和副作用,对患者的治疗和生活造成极大的影响〔1〕。近年来,中药在白血病治疗方面的作用得到广泛关注,中药在抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、联合放化疗、逆转多药耐药等方面效果显著〔2〕。美洲大蠊Periplaneta americana L.隶属蜚蠊科,古时多用于创伤修复、祛腐生肌、清热解毒等,现研究发现美洲大蠊具有增强免疫力、抗病毒等多种药理活性,对多种肿瘤细胞有不同程度的抑制作用,而且原材料丰富,容易获取,应用前景广泛。有研究〔3-4〕表明,通过不同提取方法得到的多种美洲大蠊提取物对K562 细胞的增殖有不同程度的抑制作用,但具体机制尚不清楚。美洲大蠊提取物CⅡ-3 是提取于美洲大蠊的一种小分子肽〔5〕,主要通过抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤血管的生成及转移、免疫调节、逆转多药耐药等方面发挥其抗癌作用〔6〕。本研究探究美洲大蠊提取物CⅡ-3 对人白血病细胞K562 增殖的影响,为开发低毒有效的抗肿瘤药物提供实验基础。

1 材料与仪器

1.1 材料美洲大蠊提取物CⅡ-3 由大理大学药学院张成桂教授提供;K562 细胞(齐式生物科技有限公司);RPMI1640 培养基(美仑生物公司,批号:C0039);胎牛血清(Vivacell 公司,批号:2025067);磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)(北京索莱宝科技公司,批号:P1003);细胞周期检测试剂盒(KeyGEN BioTECH 公司,批号:KGA512);磷酸化p53 抗体(Abcam 公司,批号:ab32132);羊抗兔抗体(Sigma 公司,批号:40839);ECL 增强化学发光检测试剂盒(PIERCE 公司,批号:32209)。

1.2 仪器多功能酶标仪(BIO-RAD 公司);高压蒸气灭菌器(Sanyo 公司);生物安全柜(苏州安泰空气技术有限公司);二氧化碳培养箱(Sanyo 公司);低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司);倒置显微镜(Motic 公司);细胞计数板(上海医用仪器厂);流式细胞仪(Beckman 公司);垂直板电泳转移装置(BIO-RAD 公司);图像分析系统(LabworksTM Analysis Software 公司)。

2 实验方法

2.1 细胞培养 用RPMI1640 培养基(含10% 胎牛血清)于37 ℃、5%CO2培养箱中培养K562 细胞,培养2~3 d 计数并传代,取对数生长期细胞进行后续实验。

2.2 CCK-8 法检测细胞增殖活性取对数生长期的K562 细胞,以1×105个/mL 的密度将细胞接种于96 孔板内,每孔100 μL,实验组分别加入终浓度为5、10、20、40、80、160 μg/mL 的CⅡ-3,每孔50 μL,每个浓度设置3 个复孔,并设空白对照组(仅有K562 细胞,不加CⅡ-3,以下简称“对照组”),置于37 ℃、5% CO2培养箱内分别培养24、48、72 h,加入10 μL CCK-8 溶液,孵育2 h,酶标仪测定450 nm波长处的吸光度(OD)值,并计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=[(对照组OD 值-实验组OD值)/(对照组OD 值-空白组OD 值)]×100%,其中,空白组仅有培养基,用于消除计算时培养基内酚红对OD 值的影响。

2.3 细胞集落形成实验 收集对照组细胞和经80 μg/mL CⅡ-3 处理72 h 的细胞并计数,以1×103个/mL的密度接种于24 孔板内,每孔500 μL,每组设置3个复孔,于培养箱内孵育7 d,倒置显微镜下观察并计数细胞集落数,以细胞数>50 为1 个集落,计算细胞集落形成率和细胞集落抑制率。细胞集落形成率(%)=(细胞平均集落数/每孔加入的细胞数)×100%;细胞集落抑制率(%)=[(对照组细胞集落数-实验组细胞集落数)/对照组细胞集落数]×100%。

2.4 流式细胞术分析细胞周期收集对照组细胞和经80 μg/mL CⅡ-3 处理72 h 的细胞,预冷PBS洗涤,加入1 mL 75%乙醇吹打混匀,4 ℃固定过夜。1 000 r/min 离心后收集细胞,PBS 洗涤,加入碘化丙啶染色液,37 ℃避光温浴30 min,流式细胞仪测定488 nm 波长处荧光强度。

2.5 蛋白质印迹法检测磷酸化p53 蛋白表达 收集对照组细胞和经80 μg/mL CⅡ-3 处理72 h 的细胞,PBS 洗涤,加入蛋白裂解液提取总蛋白,BCA 法测定蛋白浓度,取20 μg 蛋白进行上样。经电泳分离后转移至PVDF 膜上,5%脱脂牛奶封闭1 h,加入一抗磷酸化p53(1∶500 稀释),4 ℃孵育过夜,TBST 缓冲液洗涤条带3 次,加入二抗(1∶1 000 稀释)孵育1.5 h,ECL 曝光液显色后凝胶成像系统采集图像,测定蛋白条带灰度值,计算蛋白相对表达量。

2.6 统计分析采用SPSS 26.0 软件进行统计分析,计量资料以()表示,P<0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 CⅡ-3 对K562 细胞增殖的影响CCK-8 法检测结果显示:24、48、72 h 时,不同浓度的CⅡ-3对K562 细胞的增殖均有抑制作用,随着作用时间延长,大多数浓度CⅡ-3 对K562 细胞增殖抑制作用增强,因此,选择72 h 作为培养时间。在作用时间为72 h 时,CⅡ-3 浓度为80 μg/mL,细胞增殖抑制率最高,与大多数作用浓度和作用时间相比,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。因此,选择80 μg/mL CⅡ-3 作用72 h 进行后续实验。

表1 CⅡ-3 对K562 细胞增殖的抑制率(%,,n=3)

表1 CⅡ-3 对K562 细胞增殖的抑制率(%,,n=3)

注:在作用时间相同的情况下,与80 μg/mL CⅡ-3 比较*P<0.05;CⅡ-3 浓度为80 μg/mL 时,与作用72 h 比较△P<0.05。

3.2 CⅡ-3 对K562 细胞集落形成能力的影响与对照组相比,80 μg/mL CⅡ-3 作用于K562 细胞72 h 后,实验组细胞集落数明显减少,细胞集落形成率显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。见表2、图1。

图1 CⅡ-3 对K562 细胞集落形成能力的影响(×100)

表2 CⅡ-3 对K562 细胞集落形成能力的影响(,n=3)

表2 CⅡ-3 对K562 细胞集落形成能力的影响(,n=3)

注:与对照组相比**P<0.01。

3.3 CⅡ-3 对K562 细胞周期的影响流式细胞术检测结果显示,与对照组相比,80 μg/mL CⅡ-3 作用于K562 细胞72 h 后,G0/G1 期细胞比例明显升高,S 期细胞比例显著降低,差异有统计学意义(P<0.01)。见表3、图2。

图2 CⅡ-3 对K562 细胞周期的影响

表3 CⅡ-3 对K562 细胞周期的影响(%,,n=3)

表3 CⅡ-3 对K562 细胞周期的影响(%,,n=3)

注:与对照组相比**P<0.01。

3.4 CⅡ-3 对K562 细胞磷酸化p53 蛋白表达的影响蛋白质印迹法结果显示,与对照组相比,80 μg/mL CⅡ-3 作用72 h 后,磷酸化p53 蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

图3 CⅡ-3 对K562 细胞磷酸化p53 蛋白表达的影响

4 讨论

CML 是一种起源于造血干细胞的骨髓增生性疾病,化疗是目前临床上主要治疗方案,但化疗所导致的副作用极大地影响患者的治疗效果和生活质量〔7〕。因此,寻找高效、低毒副作用的药物成为治疗的新目标〔8〕。

高三尖杉酯碱是从我国特有植物粗榧中提取的一种生物碱,研究〔9〕表明其具有抗肿瘤活性,对K562 细胞有抑制增殖、诱导凋亡、阻滞细胞周期等作用,在临床治疗中,广泛用于治疗急性髓系白血病、慢性粒细胞白血病和骨髓增生异常综合征,2012 年被美国食品药品监督管理局批准用于治疗伊马替尼耐药的CML 患者,由此可见中药在白血病治疗方面有着很大的潜力。美洲大蠊,古时称蜚蠊,其药用价值最早在《神农本草经》中记载,具有活血散瘀的功效〔10〕。有研究〔11〕结果表明,美洲大蠊在抗肺癌、肝癌、胃癌、结肠癌等方面疗效显著,有着良好的应用前景。

研究〔3〕表明,美洲大蠊提取物对K562 细胞、人原髓细胞白血病HL-60 细胞和小鼠淋巴样瘤P388D1 细胞的生长均有抑制作用。本研究中,CCK-8法测定结果显示,美洲大蠊提取物CⅡ-3 浓度为80 μg/mL、作用72 h 时,对K562 细胞增殖抑制率最高,为(57.8±1.0)%,故选择此浓度及作用时间进行后续实验。集落形成实验可以直观地反映肿瘤细胞的群体依赖性和增殖能力〔12〕,经80 μg/mL CⅡ-3作用72 h 的K562 细胞其集落形成能力明显下降,以上结果说明CⅡ-3 能够抑制K562 细胞增殖。

细胞增殖依赖于正常的细胞周期进程,包括G0/G1 期、S 期、G2 期、M 期4 个时期,癌细胞的细胞周期调节失调,细胞无限增殖分裂〔13〕,这种异常的细胞周期进程是导致肿瘤发生的基本机制之一〔14〕。处于G0/G1 期的细胞被称为静止期或非增殖状态,将肿瘤细胞阻滞在该周期,就能达到抑制肿瘤细胞增殖的目的〔15〕。本研究中,流式细胞术结果显示,与对照组相比,实验组阻滞在G0/G1 期的K562细胞显著增加,S 期的细胞明显减少,由此可知CⅡ-3通过阻滞肿瘤细胞周期,从而抑制K562 细胞增殖。

p53 蛋白可以使细胞周期阻滞在G1 期,还可以间接抑制细胞周期依赖激酶的活性,进一步抑制细胞增殖〔16〕。有研究〔17〕表明,姜黄素衍生物能够通过上调p53 蛋白表达水平导致细胞周期阻滞,抑制细胞增殖。p53 蛋白的磷酸化与癌症关系密切,p53蛋白的磷酸化水平增加可以抑制肿瘤的形成〔18〕。p53 蛋白的磷酸化修饰是稳定和增强p53 蛋白转录活性的关键〔19〕,因此,本研究中检测了磷酸化p53蛋白的表达,与对照组相比,CⅡ-3 诱导后的K562细胞磷酸化p53 蛋白表达水平升高,提示CⅡ-3 通过调控p53 蛋白抑制K562 细胞增殖。

本研究探讨了美洲大蠊提取物CⅡ-3 对K562细胞增殖的影响,结果表明,CⅡ-3 可以抑制K562细胞的增殖,降低细胞集落形成率,使阻滞在G0/G1期的细胞比例增加,S 期的细胞比例减少,并上调p53 蛋白的表达。该结果为后续进行深入研究其具体机制奠定了基础,为美洲大蠊提取物CⅡ-3 的临床应用提供新思路。

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